开发靶向鸟苷酸生物合成限速酶GuaB的抑制剂用于治疗结核分枝杆菌感染

《ACS Infectious Diseases》：Development of GuaB Inhibitors to Treat Mycobacterium tuberculosis Infection

　　

结核分枝杆菌（Mtb）每年造成的死亡人数超过其他任何一种感染性疾病。流通中Mtb对标准治疗方案的耐药性是一个紧迫的全球公共卫生危机，亟需新型抗生素治疗方案。研究人员开发了极高效、口服生物可利用的、抑制肌苷-5′-单磷酸脱氢酶（IMPDH，由GuaB2编码）的小分子抑制剂，该酶催化从头鸟嘌呤生物合成中的限速步骤。这些抑制剂在细胞外、细胞内和缺氧环境中对Mtb表现出杀菌活性，上述环境可反映患者晚期疾病病理特征。Mtb GuaB2抑制剂（GuaBi）在三种不同的体内小鼠Mtb肺部感染模型中有效：C57BL/6超急性模型、C57BL/6慢性模型和C3HeB/FeJ（Kramnik）模型。在以胞内Mtb为主的慢性BALB/c感染模型中未观察到获益，而在C3HeB/FeJ模型中，含GuaBi的贝达喹啉（B）、普托马尼（P）和莫西沙星（M）治疗方案使一半小鼠的快速清除可培养Mtb感染得以实现。值得注意的是，C3HeB/FeJ模型可重现晚期病理生理学和异质性疾患，包括干酪样坏死性肉芽肿、胞内与胞外Mtb储库以及致死性进展性感染。这些结果支持在具有复发能力临床前模型中进一步评价含GuaBi治疗方案。

研究背景方面，结核分枝杆菌（Mtb）是结核病病原体的兼性人类病原体，全球每年导致约130万人死亡，超过10亿人潜伏感染，且对一线抗生素耐药使治疗选择减少。Mtb可在巨噬细胞胞内生存、在肉芽肿中形成潜伏感染，并进展为缺氧、富脂、含大量胞外菌的干酪样坏死病灶；其复制态、休眠态、非复制态和不同氧合及营养环境使单一抗生素难以根除，因此WHO推荐4—6个月多药联合方案，耐药结核治疗更久且安全性风险更高。既往靶向从头嘌呤合成酶PurF在小鼠模型中有效，说明嘌呤补救不足以维持感染；但早期GuaB2抑制在BALB/c小鼠中因嘌呤补救假说而令人失望。Mtb基因组中GuaB1为鸟苷单磷酸还原酶，GuaB3无催化活性，仅GuaB2具有功能性IMPDH活性且体外与体内均必需，故GuaB2是具吸引力的新靶点。该研究由研究人员开展，目的是获得可口服、长程给药、在先进病理模型中有效的GuaB2抑制剂，并评估其单药及联合方案在急性、慢性与高难度C3HeB/FeJ小鼠肺部感染模型中的疗效。

主要关键技术方法方面，研究人员采用人THP-1巨噬细胞与C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）评价胞内活性；以21% O₂与1% O₂培养体系评价复制与非复制缺氧菌；通过二维棋盘法测算G1与利福平、利奈唑胺、贝达喹啉、莫西沙星、氯法齐明分数抑菌浓度（FIC）以判断协同或拮抗；利用Mtb GuaB2ΔCBS与IMP共结晶解析G9结合模式；在C57BL/6、BALB/c及C3HeB/FeJ小鼠中分别建立高剂量气管接种、低剂量气溶胶慢性感染与56天进展性感染队列，以菌落形成单位（CFU）计数评价单药和B/P/M、B/P/U等联合方案；并以自发耐药突变频率与靶基因测序分析耐药机制。

研究结果方面，Characterization of Mtb GuaB2 Inhibitor G1 Activity in Different Environments部分，研究人员通过 broth 培养、THP-1与BMDM感染、缺氧培养发现G1对Mtb GuaB2 IC₅₀为0.3 nM，对H37Rv MIC为0.3 μM；外源鸟嘌呤或鸟苷需100 μM才逆转杀菌，黄嘌呤不能；G1在THP-1中IC₅₀为0.058 μM，在BMDM中10×与40× MIC具杀菌性；在1% O₂非复制状态下与复制态杀菌浓度相当，而异烟肼（INH）浓度位移明显，说明G1可覆盖胞内、胞外与缺氧宿主环境。

Antibiotic Combinations Using GuaBi In Vitro部分，研究人员以8点棋盘Alamar blue读出FIC，发现G1与利福平、利奈唑胺、氯法齐明协同，与贝达喹啉、莫西沙星无拮抗，无阴性相互作用，提示GuaBi可增补标准方案。

Discovery of Mtb GuaB2 Inhibitor Active against Mtb H37Rv In Vitro and In Vivo部分，研究人员由G1推进至G9，G9对Mtb GuaB2 IC₅₀为0.94 nM，对毒力H37Rv MIC为0.058 μM，对人同源hIMPDH2选择性高，小鼠口服生物利用度75%，预测人半衰期12.6 h；急性C57BL/6模型中100 mg/kg b.i.d.才显著降菌，说明体内需约10× broth MBC以覆盖胞内储库。

High-Resolution Co-Crystal Structure of G9 with Mtb GuaB2ΔCBS部分，研究人员解析1.35 ?共晶结构（PDB 12LG），G9结合于四聚体两原体界面，靠近IMP并占据NADH辅因子腔，芳香头基与IMP形成π–π堆积，四氢吡喃与Gly336形成氢键，尾部经Ala285、Glu458、Tyr487等介导种属选择性，证明该骨架可保留生化效力并指导药物化学优化。

Characterization of Mtb GuaB2 Inhibitor G9 Activity In Vitro部分，研究人员进行time-kill与耐药选择：G9在H37Rv中21天降菌4 log；INH 7天后复长，耐药突变集中于katG；G9在10× MIC耐药频率低于1×10^-9，耐药突变仅为GuaB2 E458Q，说明靶向耐药发生率极低。

Single-Agent Activity of G9 in Acute and Chronic Mtb In Vivo Infection Models部分，急性C57BL/6中G9剂量比例降菌，100 mg/kg显著；慢性C57BL/6中200 mg/kg q.d. 56天显著降菌；说明长期抑制GuaB2在两类模型中单药可行，但需充分24 h未结合药物覆盖。

Antibiotic Combinations Including G9 in Chronic BALB/c and C3HeB/FeJ Lung Infection Models部分，慢性BALB/c Erdman模型中G9加入B/P等方案无显著增益，甚至B/P+G9略增CFU；而C3HeB/FeJ模型中单药G9一个月显著降菌，两个月时B/P/M/G9较对照显著清除且部分小鼠肺内无可培养Mtb，B/P/U/G9亦见无菌小鼠，说明GuaBi在具坏死肉芽肿与胞外储库模型中价值更高。

讨论部分总结方面，研究人员指出嘌呤补救浓度（巨噬细胞内约40 μM、患者肺组织约5 μM）低于逆转GuaB2抑制阈值，故体内从头鸟嘌呤合成阻断有效。BALB/c主要为胞内潜伏感染，不反映人类晚期异质病理；C3HeB/FeJ具干酪样坏死、缺氧胞外菌与胞内胞外混合储库，更接近人结核，G9加入B/P/M可加速清除非复制持留菌，机制上指向对坏死肉芽肿中胞外种群更有效。文中也指出BALB/c失效可能源于病变穿透、巨噬细胞内药理改变、靶上调或外排，但均属谨慎推测；核心结论是需在复发能力临床前模型中验证含GuaBi方案。

结论部分翻译为：G9在ADME与药代性质上的显著改善，使长期体内GuaB2抑制首次得到严格检验。G9加速坏死病灶杀菌，直击结核治疗最大难点，即清除导致复发之非复制持留种群。GuaBi与利福平、利奈唑胺等在体外呈现协同，说明其可作为未来方案的多功能组分。C3HeB/FeJ模型中B/P/M/G9两个月杀菌改善支持在复发能力临床前模型中进一步评价含GuaBi方案；若成功，可通过缩短疗程与提高依从性，从根本改变全球结核格局。