整合代谢组学与肠道微生物群分析揭示肉鸡骨骼疾病中的三羧酸循环功能障碍及L-苹果酸的保护作用

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Integrated metabolomic and gut microbiota analyses reveal TCA cycle dysfunction in broiler skeletal disorders and the protective effect of L?malic acid

　　

背景：骨骼疾病对集约化肉鸡生产构成重大挑战。然而，肉鸡骨骼发育异常的代谢机制仍不清楚。本研究旨在通过多组学分析揭示其潜在机制，并评估外源性L-苹果酸补充的改善效果。 结果：异常组表现出血清钙和磷浓度降低，以及骨钙和磷含量下降。这些变化伴随骨几何特性和微结构参数的恶化。异常组成骨相关基因表达下调，而破骨细胞相关基因的mRNA表达水平显著高于正常组（P < 0.05）。血清代谢组学揭示差异富集通路主要与能量代谢相关，尤其是三羧酸循环（TCA循环）。同时，异常组中编码关键糖酵解酶和电子传递链关键复合物的基因mRNA表达水平升高。肠道微生物群分析显示，异常组中有害细菌丰度增加，与能量代谢相关的微生物显著减少（P < 0.05）。靶向分析进一步确定TCA循环中间产物富马酸和苹果酸是区分骨骼健康状态的可靠生物标志物。早期日粮补充L-苹果酸通过增加TCA活性改善了肉鸡骨健康，表现为骨矿化增强、骨微结构参数改善以及OPG/RANKL比值升高。 结论：肉鸡骨骼异常与肠道微生物群失调伴随TCA循环代谢紊乱密切相关。外源性L-苹果酸补充通过增强TCA循环相关活性改善了骨健康，支持TCA循环相关代谢在骨骼发育中的功能作用。

论文解读：整合代谢组学与肠道微生物群分析揭示肉鸡骨骼疾病中的三羧酸循环功能障碍及L-苹果酸的保护作用

一、研究背景与目的

骨骼疾病是集约化肉鸡生产中面临的重大挑战。金陵黄羽肉鸡是中国优质商业品种，具有肉质细嫩、风味良好、皮薄骨细等特点。近年来，遗传改良使黄羽肉鸡体重从约1公斤增加至约3公斤，生产周期缩短，带来了可观的经济效益。然而，体重的增加并未伴随骨骼系统的比例发育，打破了组织生长与骨骼发育之间的平衡，损害了骨矿化，导致黄羽肉鸡在生产中频繁出现骨骼疾病。与此同时，随着鸡肉需求的增长和对更高生产效率的追求，笼养已成为肉鸡的主要饲养方式，多层笼养系统被广泛采用。在笼养条件下，肉鸡活动空间受限，体力活动减少，这些因素使肉鸡极易发生各种骨骼疾病，如外翻-内翻畸形、胫骨软骨发育不良、股骨头坏死和骨骺板异常等。在屠宰和运输过程中，不成熟的骨骼结构增加了骨折风险（主要发生在腿部和翅膀）以及肉品质缺陷，最终导致动物福利受损和重大经济损失。

肉鸡骨骼异常的病因极为复杂，但骨骼生长和稳态受成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收这一偶联过程调控。两者之间的失衡，尤其是骨吸收超过骨形成时，可导致一系列骨骼病理变化。以往大多数研究旨在通过直接日粮补充各种功能性添加剂和营养干预来改善骨健康，但许多干预未能针对潜在病因，可能影响添加剂效果并限制其在商业生产中的应用。因此，本研究旨在通过建立基于综合步态评分和血清钙磷乘积的分组，系统比较正常与异常骨骼发育之间的表型差异，通过多组学分析阐明骨骼异常的根本机制，并基于关键靶点评估外源性L-苹果酸补充改善肉鸡骨健康的效果，为开发靶向干预措施和新型饲料添加剂提供理论基础。

二、主要技术方法

研究分为两个实验。实验1在新疆创裕家禽育种有限公司进行，选取同一批次、相同管理条件下饲养的金陵黄羽公鸡，在70日龄屠宰当天，根据六点评分系统初步筛选步态明显正常和明显异常的肉鸡各30只候选，再结合血清钙磷乘积低于正常范围下限的标准，最终每组随机选取15只进行下游分析。实验2选取480只1日龄金陵黄羽公鸡，随机分为四组，每组六个重复，每重复20只，试验期21天，对照组饲喂基础日粮，三个处理组分别添加0.05%、0.15%和0.3%的L-苹果酸。主要技术方法包括：步态评分与血清钙磷乘积评估腿部健康；骨测量与几何特性计算；血清和骨组织钙磷含量及骨代谢标志物检测；显微计算机断层扫描（micro-CT）和HE染色评估骨微结构；实时荧光定量PCR（qPCR）分析骨代谢相关基因mRNA表达；液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行血清非靶向代谢组学分析；16S rRNA基因测序分析盲肠微生物群组成；靶向代谢组学验证关键代谢物；免疫荧光染色检测骨形成蛋白表达。

三、研究结果

骨骼表型特征分析： 异常组血清钙、磷浓度及骨钙、磷和灰分含量显著降低，表明笼养条件下部分肉鸡骨钙化受损。异常组血清骨吸收标志物TRAP和CTSK含量显著升高，而骨形成标志物PINP、COL1A1和BALP浓度显著降低。micro-CT和HE染色显示异常组呈低骨量表型，表现为髓腔扩大、骨小梁稀疏和连接性受损，骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、连接性、连接密度（Conn.D）、骨矿物质密度（BMD）、骨矿物质含量（BMC）和组织矿物质含量（TMC）均存在显著差异。异常组胫骨和肱骨的骨重、骨长、近端宽度、平均相对壁厚（MRWT）、垂直壁厚（WTv）、垂直皮质指数（CIv）、横截面惯性矩（CSMI）和皮质横截面积（CSA）均显著降低。

血清代谢组学分析： 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示正常组和异常组血清代谢谱明显分离。KEGG通路分析鉴定出68条富集代谢通路，其中三羧酸（TCA）循环、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、氧化磷酸化（OXPHOS）和溶酶体通路显著改变。氨基酸代谢方面，酪氨酸、色氨酸、脯氨酸和组氨酸代谢通路存在显著差异，这些氨基酸及其衍生物最终被分解为TCA循环中间产物。

mRNA表达和线粒体功能分析： 异常组骨吸收相关基因RANKL、MMP9、NFATC1、CTSK、TRAP和ATP6V0D2的mRNA表达显著升高，而骨形成相关基因OCN、OPN、ALPL和RUNX2表达显著降低。异常组糖酵解关键酶基因HK2、PFKM、PKLR、LDHA和ENO1的mRNA表达显著升高，电子传递链复合物关键亚基基因SDHB、NDUFB8、UQCRC2和COX5A的mRNA水平也显著升高。异常组骨组织中ATP和活性氧（ROS）水平显著升高。

肠道微生物群组成分析： 基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示两组微生物群落结构明显分离。属水平上，异常组Phocaeicola_A、Phascolarctobacterium_A、Nanosyncoccus和Avispirillum丰度显著升高，而Paludicola、Dysosmobacter、Pseudobutyricicoccus、Lawsonibacter、PeH17、Faecimonas、Ruminococcus_E、WRAI01、Phocea和Fimiplasma丰度显著降低。Spearman相关分析显示肠道微生物与血清骨代谢标志物之间存在显著关联。

相关性和靶向代谢物验证： TCA循环相关代谢物与特定肠道微生物群之间存在显著相关性。靶向定量分析显示富马酸（FA）、苹果酸（MA）和琥珀酸（SA）在正常组和异常组之间存在显著差异，且与骨形成标志物呈正相关，与骨吸收标志物呈负相关。六种机器学习模型评估显示FA和MA具有中等到高的诊断性能，FA和MA组合在K近邻和逻辑回归模型中AUC值达到1.00。

L-苹果酸对骨几何特性的影响： 补充不同水平L-MA后，胫骨重、骨长、Pew、WTv、CSMI和CSA在不同处理组间存在显著差异，中等剂量组（MMA）各项指标优于其他处理组。肱骨骨重、骨长和Pew在不同处理组间存在显著差异。

L-苹果酸对钙磷代谢的影响： 补充L-MA显著提高血清钙浓度，显著降低血清磷浓度和钙磷乘积。中等剂量L-MA显著提高胫骨钙和磷含量。

L-苹果酸对骨组织形态学、代谢标志物和基因表达的影响： 与对照组相比，L-MA补充后骨小梁更致密，小梁连接性更好。L-MA补充显著提高PINP和BALP浓度，LMA和MMA组血清TRAP浓度显著降低。中高剂量L-MA显著提高COL1A1和OPG表达，HMA组RUNX2表达显著升高。MMA组显著降低TRAP、CTSK、ATP6V0D2和RANKL的mRNA表达，OPG/RANKL比值显著高于其他处理组。

L-苹果酸对骨微结构参数和骨形成蛋白的影响： 中等剂量L-MA显著增加BV/TV、Tb.N、BMD和BMC，显著降低Tb.Sp和Tb.Pf。免疫荧光染色显示MMA组骨小梁上COL1A1和OCN的表达显著高于对照组。

L-苹果酸对能量代谢物和线粒体功能的影响： 靶向分析显示CON组和MMA组之间有13种代谢物存在显著差异，包括dTMP、草酸、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖、脯氨酸、肌酐、尿苷、马来酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸、3-羟基丁酸、异柠檬酸和甜菜碱。KEGG富集分析显示柠檬酸循环（TCA循环）和氧化磷酸化通路存在显著差异。MMA组SDHB、NDUFB8、UQCRC2和COX5A的mRNA水平显著高于对照组。

四、讨论与结论

现代集约化肉鸡养殖虽然改善了管理条件和饲料品质，但伴随的骨骼问题不容忽视。骨几何参数决定骨的生物学功能和力学性能，钙和磷是骨骼生长所必需的营养物质，以羟基磷灰石形式沉积于骨组织。骨稳态由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡维持。本研究中异常组骨形成标志物降低而骨吸收标志物升高，表明笼养肉鸡骨骼异常可能源于骨吸收增强，破坏了骨组织稳态。RUNX2是成骨细胞增殖和成熟过程中的关键转录因子，BALP是成骨早期生化标志物。

研究结论：肉鸡骨骼异常与肠道微生物群失调伴随TCA循环代谢紊乱密切相关。外源性L-苹果酸补充通过增强TCA循环相关活性改善了骨健康，表现为骨矿化增强、骨微结构参数改善以及OPG/RANKL比值升高，支持TCA循环相关代谢在骨骼发育中的功能作用。该研究发表在《Journal of Animal Science and Biotechnology》。