通过对配对的临床利什曼原虫（Mundinia martiniquensis）分离株进行转录组分析，发现了与两性霉素B敏感性降低相关的候选通路，并鉴定出一种新的利什曼病毒变体

《Parasites & Vectors》：Transcriptomic profiling of paired clinical Leishmania (Mundinia) martiniquensis isolates reveals candidate pathways associated with reduced amphotericin B susceptibility and identifies a novel leishbuvirus variant

　　

摘要

背景

莱什曼原虫（Mundinia）martiniquensis是泰国内脏利什曼病的一个新发原因，尤其是在晚期HIV感染者中。关于使用两性霉素B（AmB）治疗后的临床复发和治疗失败的报告引发了人们对这种病原体药物敏感性降低的担忧。然而，该物种药物敏感性降低的分子基础仍知之甚少。

方法

从同一患者身上获取的治疗前（CULE7.2）和临床复发后（CULE8）的成对L. martiniquensis分离株进行了比较，比较方法包括体外AmB敏感性检测、透射电子显微镜（TEM）观察以及对游动变形虫和无菌培养的变形虫进行转录组分析。在转录组分析中，CULE8在持续暴露于0.3微摩尔亚致死浓度AmB的条件下进行培养，以观察其在药物作用下的转录谱；而CULE7.2则在没有AmB的条件下进行培养。分别在每个发育阶段进行了差异表达分析、层次聚类和功能富集分析。此外，还通过从头组装未映射的RNA-seq序列、丰度分析、负染色TEM观察、系统发育分析和比较结构建模进一步研究了病毒序列的特征。

结果

与CULE7.2相比，CULE8在体外表现出较低的AmB敏感性。对CULE7.2游动变形虫在急性AmB处理后的超微结构观察显示，细胞质中出现明显液泡化现象、类脂质包涵体、线粒体肿胀以及核膜局部断裂。转录组分析揭示了两个分离株在各个发育阶段的转录差异：在游动变形虫中，参与甾醇和脂质代谢、膜转运、蛋白质合成、运动以及代谢和调控过程的基因显著下调，包括甾醇C24还原酶和上游甲瓦隆途径相关的酶；而与硫基氧化还原稳态相关的基因表达增加。相比之下，无菌培养的变形虫中，与脂质代谢、氧化还原稳态、蛋白质合成和蛋白质稳态相关的基因表达增加，同时转运和基因组维持基因也出现广泛的下调。尽管主要是阶段特异性的转录模式，但有一小部分基因在两个阶段表现出一致的调控特征，包括参与脂质代谢和转运的基因；而与硫基氧化还原稳态相关的基因在两个阶段均表达增加。由于这些分离株是在不同的药物暴露条件下检测的，这些模式可能反映了分离株本身的特性以及它们对持续AmB暴露的响应。从头组装从CULE8中恢复了具有遗传多样性的利什布病毒（leishbuvirus）的完整L链和S链基因组片段，据我们所知，这是首次在东南亚L. martiniquensis分离株中对利什布病毒进行分子水平的表征。比较结构建模支持预测的RNA依赖性RNA聚合酶核心和Motif C结构的保守性，而负染色TEM观察到的结构与病毒样颗粒一致。CULE8在两个阶段中的病毒RNA丰度均较高。

结论

这种成对分离株的比较揭示了超出甾醇代谢范围的转录差异，涉及多种细胞过程，且在游动变形虫和无菌培养的变形虫中表现出不同的模式。这些发现扩展了与L. martiniquensis对AmB敏感性降低相关的分子机制，并指出了后续功能研究的潜在途径。虽然在复发后的分离株中观察到更高的利什布病毒RNA丰度，但其生物学意义及其与AmB敏感性降低或临床复发之间的关联仍有待确定。总体而言，这项具有假设生成性的研究提供了转录组学见解和病毒学发现，需要在匹配的实验条件下对其他独立分离株进行验证。

图形摘要

背景

莱什曼原虫（Mundinia）martiniquensis是泰国内脏利什曼病的一个新发原因，尤其是在晚期HIV感染者中。关于使用两性霉素B（AmB）治疗后的临床复发和治疗失败的报告引发了人们对这种病原体药物敏感性降低的担忧。然而，该物种药物敏感性降低的分子基础仍知之甚少。

方法

从同一患者身上获取的治疗前（CULE7.2）和临床复发后（CULE8）的成对L. martiniquensis分离株进行了比较，比较方法包括体外AmB敏感性检测、透射电子显微镜（TEM）观察以及对游动变形虫和无菌培养的变形虫进行转录组分析。在转录组分析中，CULE8在持续暴露于0.3微摩尔亚致死浓度AmB的条件下进行培养，以观察其在药物作用下的转录谱；而CULE7.2则在没有AmB的条件下进行培养。分别在每个发育阶段进行了差异表达分析、层次聚类和功能富集分析。此外，还通过从头组装未映射的RNA-seq序列、丰度分析、负染色TEM观察、系统发育分析和比较结构建模进一步研究了病毒序列的特征。

结果

与CULE7.2相比，CULE8在体外表现出较低的AmB敏感性。对CULE7.2游动变形虫在急性AmB处理后的超微结构观察显示，细胞质中出现明显液泡化现象、类脂质包涵体、线粒体肿胀以及核膜局部断裂。转录组分析揭示了两个分离株在各个发育阶段的转录差异：在游动变形虫中，参与甾醇和脂质代谢、膜转运、蛋白质合成、运动以及代谢和调控过程的基因显著下调，包括甾醇C24还原酶和上游甲瓦隆途径相关的酶；而与硫基氧化还原稳态相关的基因表达增加。相比之下，无菌培养的变形虫中，与脂质代谢、氧化还原稳态、蛋白质合成和蛋白质稳态相关的基因表达增加，同时转运和基因组维持基因也出现广泛的下调。尽管主要是阶段特异性的转录模式，但有一小部分基因在两个阶段表现出一致的调控特征，包括参与脂质代谢和转运的基因；而与硫基氧化还原稳态相关的基因在两个阶段均表达增加。由于这些分离株是在不同的药物暴露条件下检测的，这些模式可能反映了分离株本身的特性及其对持续AmB暴露的响应。从头组装从CULE8中恢复了具有遗传多样性的利什布病毒（leishbuvirus）的完整L链和S链基因组片段，据我们所知，这是首次在东南亚L. martiniquensis分离株中对利什布病毒进行分子水平的表征。比较结构建模支持预测的RNA依赖性RNA聚合酶核心和Motif C结构的保守性，而负染色TEM观察到的结构与病毒样颗粒一致。CULE8在两个阶段中的病毒RNA丰度均较高。

结论

这种成对分离株的比较揭示了超出甾醇代谢范围的转录差异，涉及多种细胞过程，且在游动变形虫和无菌培养的变形虫中表现出不同的模式。这些发现扩展了与L. martiniquensis对AmB敏感性降低相关的分子机制，并指出了后续功能研究的潜在途径。虽然在复发后的分离株中观察到更高的利什布病毒RNA丰度，但其生物学意义及其与AmB敏感性降低或临床复发之间的关联仍有待确定。总体而言，这项具有假设生成性的研究提供了转录组学见解和病毒学发现，需要在匹配的实验条件下对其他独立分离株进行验证。

图形摘要