《Pediatric Research》：Alterations of endothelial cell bioenergetics in congenital diaphragmatic hernia
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背景：先天性膈疝（CDH）肺血管发育以血管生成受损和病理性重塑为特征，进而促发肺高血压/肺发育不全。线粒体调控内皮能量、氧化还原平衡和血管生成信号，提示其参与CDH血管病变。方法：研究人员从健康与CDH新生儿脐带静脉分离内皮细胞（EC）。通过细胞外通量分析评估
背景：先天性膈疝（CDH）肺血管发育以血管生成受损和病理性重塑为特征，进而促发肺高血压/肺发育不全。线粒体调控内皮能量、氧化还原平衡和血管生成信号，提示其参与CDH血管病变。方法：研究人员从健康与CDH新生儿脐带静脉分离内皮细胞（EC）。通过细胞外通量分析评估线粒体生物能量学与糖酵解酸化；通过流式细胞术检测氧化应激、线粒体内膜电位和线粒体质量；通过qPCR评估线粒体DNA拷贝数（mtDNA-CN），通过显微镜评估线粒体形态。结果：CDH内皮细胞表现为最大呼吸能力增强、质子漏增加、ATP偶联效率下降，基础糖酵解活动增强；伴随线粒体超氧化物和细胞活性氧增加，以及随严重度相关的膜电位丧失。尽管MitoTracker Green降低，mtDNA-CN未变，共聚焦成像显示高度分支、外周分布的网状结构。结论：上述数据界定了一种独特的内皮线粒体表型，以代谢激活、生物能量效率低和氧化应激为标志，同时上调糖酵解与氧化磷酸化而非向糖酵解偏移；结构重塑但线粒体含量保留，支持质性重塑。意义：该研究提供CDH中罕见的人源细胞层面证据，将线粒体功能障碍与CDH血管病理联系起来，为生物标志物和靶向治疗提供框架。
研究背景：先天性膈疝（CDH）发生率约1:2500，腹腔脏器疝入胸腔压迫肺组织，并结合尚不充分的“二次打击”导致肺发育不全；约70%患儿合并严重肺高血压（PH），其源于肺血管床发育受阻、血管 Arborization 减少及宫内血管重塑，术后肺仍不成熟，PH持续并是早期死亡主因。成人肺动脉高压（PAH）中内皮细胞常表现为糖酵解和谷氨酰胺分解增强、氧化磷酸化下降；CDH动物模型也提示代谢与氧化应激异常，但人类CDH内皮细胞线粒体改变几乎未被直接研究，既有人类证据仅限于羊水和气管吸出物等间接指标。因此，研究人员开展首项以原代人内皮细胞研究CDH线粒体生物能量、糖酵解与氧化损伤关系的工作，论文发表于《Pediatric Research》。
主要关键技术方法：研究人员建立健康婴儿与CDH婴儿脐带静脉内皮细胞（HUVEC）原代队列，CDH组≥36周孕龄并有产前MRI O/E TFLV等风险分层；以Seahorse XFe96细胞外通量分析测氧耗率（OCR）与胞外酸化率（ECAR）；以流式细胞术测CellROX、MitoSOX Red、MitoTracker Green、TMRE；以qPCR测mtDNA-CN；以COX4-I1免疫染色的共聚焦显微镜分析线粒体网络架构。
研究结果：
Patient demographics：研究人员比较母婴基线，发现CDH组早产周数更低，母亲妊娠并发症更多，但对照组专门选自无并发症妊娠，因此不能把表型简单归为母体合并症。
Cellular bioenergetics：通过MitoStress通量分析，研究人员发现CDH内皮细胞基础OCR、基础呼吸、FCCP解偶联后应激OCR、最大呼吸和备用呼吸能力均升高，同时质子漏与非线粒体呼吸增加，提示线粒体呼吸处于异常激活状态。
Glycolytic activity：通过同步ECAR分析，研究人员发现CDH内皮细胞基础ECAR与基础糖酵解ECAR升高，但寡霉素后最大ECAR无组间差异，说明基础状态已呈慢性代谢激活，而非单纯替代氧化磷酸化。
Mitochondrial content：通过流式MitoTracker Green与qPCR mtDNA-CN，研究人员发现MTG荧光下降但mtDNA-CN不变，说明内膜性质改变而非线粒体总量丢失。
Mitochondrial membrane potential：通过TMRE流式，研究人员发现总体膜电位无显著差异，但按严重度分层后，住院>20天和/或死亡、MRI O/E TFLV<40%的CDH组内TMRE下降，提示重病患者线粒体代偿受限、趋向生物能量失代偿。
Mitochondrial and cellular oxidative stress：通过MitoSOX Red与CellROX，研究人员发现CDH内皮细胞线粒体超氧化物和总细胞ROS升高，按MTG归一后差异更显著，且在常氧培养中持续存在，支持内在氧化还原调控异常。
Mitochondrial structure：通过COX4-I1共聚焦成像，研究人员发现CDH线粒体总面积、周长、分支数、分支长度和分支连接点增加，而碎片化指标form factor与aspect ratio不变，呈现高度分支、外周分布的网络重塑，符合应激诱导的线粒体过度融合样改变。
Clinical correlation：研究人员做探索性临床关联，发现最大呼吸能力高与住院延长和死亡相关，与更低MRI O/E TFLV有趋势关联，说明内皮生物能量改变与疾病严重度相关，但受样本量限制只能作为探索结论。
讨论部分总结：研究人员指出，CDH内皮并非成人PAH式“氧化磷酸化受抑、糖酵解取代”，而是糖酵解与氧化磷酸化同时上调的协调代谢激活；增加呼吸是为抵消质子漏和偶联效率下降，但代价是氧耗增加、ROS上升与代谢柔性下降。MTG下降不能被简单解释为线粒体减少，因为mtDNA-CN不变、共聚焦见网络伸长分支化，更可能是内膜蛋白、电位、氧化状态与染料滞留改变。膜电位随严重度下降提示从代偿走向失代偿；外周线粒体分布可能把ATP供应重排至皮质肌动蛋白、细胞连接和机械转导区域，也可能把氧化压力集中到细胞边缘。该表型可统一解释CDH中肺血管阻力升高与血管生成不足：线粒体超氧化物清除NO、促使eNOS解偶联，低效线粒体又不足以支撑内皮迁移、增殖和出芽。研究人员也说明HUVEC主要反映系统内皮，对肺血管是间接但合理模型，且CDH应被视为多系统发育病。
结论部分翻译：综上，研究人员证明CDH婴儿内皮细胞具有临床相关的线粒体表型，其特征为呼吸能力增强但效率降低、糖酵解同时激活、氧化应激升高、随严重度出现的膜去极化，以及线粒体网络广泛结构重塑，而线粒体DNA含量不变。这些发现支持一种协调代谢激活模型，用以补偿CDH中细胞能量需求增加和/或线粒体呼吸低效。这种线粒体重塑可能同时损害血管生成并促进CDH肺血管功能障碍，甚至通过促进氧化应激影响其他器官系统病理。因此，靶向线粒体氧化还原平衡、内皮代谢及这些改变的上下游效应，可能成为这种危重疾病的新型治疗策略。
