双硫仑逆转白念珠菌Cdr1介导的氟康唑耐药并干扰生物膜形成

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Disulfiram reverses fluconazole-resistance mediated by Cdr1 in Candida albicans and interferes with biofilm formation

　　

摘要：白念珠菌（Candida albicans）感染的发病率显著上升，尤其是在免疫功能低下的个体和接受化疗的癌症患者中。氟康唑（fluconazole）通常被用作白念珠菌感染的一线治疗药物；然而，不断增加的临床耐药性构成了重大的治疗挑战。因此，制定增强白念珠菌感染管理的新策略已变得至关重要。本研究旨在评估埃及临床白念珠菌分离株中唑类药物的耐药率，并评估双硫仑（disulfiram）与氟康唑联用对氟康唑耐药分离株的作用。共对64株白念珠菌临床分离株进行了氟康唑药敏试验，采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法（单独及与双硫仑联用）。氟康唑与双硫仑的联用进一步通过棋盘法（checkerboard method）进行评估。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析耐药决定因子的表达水平。分子对接（molecular docking）用于进一步分析。16株（25%）分离株对氟康唑耐药。与亚抑菌浓度双硫仑联用可降低耐药分离株中氟康唑的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）（2–128倍）。棋盘法结果显示氟康唑/双硫仑联用主要表现为协同作用。在氟康唑耐药分离株中，Cdr1过表达，而双硫仑（亚抑菌浓度）可触发其下调表达。对接研究表明，双硫仑可能竞争ATP结合位点，并可能干扰氟康唑与Cdr1的相互作用。此外，双硫仑对所测试的白念珠菌分离株表现出强效的抗生物膜活性。氟康唑/双硫仑联用似乎是克服白念珠菌氟康唑耐药的一种有前景的策略。需要进一步研究以验证这一发现并探索其临床潜力。要点：• 氟康唑/双硫仑联用是克服白念珠菌氟康唑耐药的一种有前景的策略 • 双硫仑触发氟康唑耐药白念珠菌中Cdr1表达的下调 • 双硫仑竞争Cdr1的ATP结合位点，破坏氟康唑-Cdr1相互作用。

双硫仑逆转白念珠菌Cdr1介导的氟康唑耐药并干扰生物膜形成——研究解读

一、研究背景与问题

白念珠菌（Candida albicans）是人类微生物组的常驻成员，通常定植于口腔和阴道黏膜。在宿主免疫功能低下、抗生素使用或激素水平改变等条件下，该菌可转化为条件致病菌，引发从浅表黏膜感染到危及生命的深部真菌病。作为机会性致病菌，白念珠菌因其高度的环境适应性、完善的耐药机制以及强大的生物膜形成能力，在临床微生物学中具有重要地位。氟康唑作为第一代三唑类抗真菌药物，凭借良好的亲脂性和低毒性长期占据白念珠菌感染一线治疗的地位。然而近年来，临床分离株对氟康唑的耐药率持续攀升，尤其在免疫功能受损患者中，耐药菌株导致治疗失败、感染复发和医院内传播的风险显著增加。氟康唑耐药机制主要包括：ERG11基因过表达增加靶酶数量，ERG11点突变降低药物与靶酶亲和力，以及外排泵基因（尤其Cdr1）过表达主动将药物泵出胞外，降低胞内药物浓度。其中，ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运蛋白Cdr1是介导唑类药物外排的关键因子，其过表达是临床氟康唑耐药最主要机制之一。埃及本土流行病学数据显示，血流感染来源白念珠菌分离株氟康唑耐药率高达58.3%，阴道分离株为11.3%，且存在长期经验性使用氟康唑和常规药敏检测不足等问题。在此背景下，本研究探索了药物再利用策略——将用于酒精依赖治疗的戒酒药双硫仑（disulfiram）与氟康唑联用，评估其在体外逆转白念珠菌氟康唑耐药和干扰生物膜形成的潜力及分子机制，旨在为临床应对日益严峻的耐药问题提供新的辅助治疗方案。

二、主要技术方法概述

研究人员从埃及代克利赫省（Dakhlya governorate）多家医院收集64株白念珠菌临床分离株（来源包括尿液22株、阴道拭子19株、血液12株、其他来源11株，收集时间为2022年5月至7月），经YPD琼脂培养、CHROMagar Candida显色培养基和芽管试验进行菌种鉴定，并以标准菌株SC5314为参照。药敏试验依据CLSI M44-A3和M27-A4标准，分别采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定氟康唑及双硫仑的最低抑菌浓度（MIC）；采用棋盘微量稀释法计算分数抑菌浓度指数（FICI）评价两药联用效果；利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测Cdr1基因的相对表达水平，以18S rRNA作为内参基因，采用2^?△△Ct法计算表达变化；运用MOE 2024.06软件开展分子对接模拟，分析双硫仑与Cdr1底物结合腔及ATP结合位点的相互作用；以组织培养板法结合结晶紫染色评估双硫仑对生物膜形成抑制和成熟生物膜清除能力。统计采用SPSS 25.0，Student's t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

三、研究结果

（一）临床分离株鉴定与氟康唑耐药率

64株临床分离株经传统真菌学方法全部鉴定为白念珠菌。纸片扩散法初筛显示16株（25%）对氟康唑耐药，微量肉汤稀释法确定其MIC范围为64–2048 μg/ml。选取6株不同耐药水平的代表菌株（Ca13、Ca14、Ca15、Ca32、Ca33、Ca39）进行后续深入研究。该耐药率高于既往埃及阴道分离株的报道，提示不同临床来源和地区耐药形势存在差异。

（二）双硫仑对氟康唑耐药的逆转效应

双硫仑单独作用于所选菌株的MIC为10–20 μg/ml。在亚抑菌浓度双硫仑存在下，氟康唑对耐药菌株的MIC显著降低，降幅达2–128倍，表明双硫仑能够有效恢复氟康唑对耐药白念珠菌的敏感性。

（三）棋盘法联合药敏评价

棋盘法结果显示，氟康唑与双硫仑联用对6株耐药菌株中3株呈协同作用（FICI≤0.5），2株呈部分协同（0.5
（四）Cdr1基因表达分析

RT-PCR结果显示，亚抑菌浓度氟康唑单独处理可使耐药菌株Cdr1基因表达较未处理对照上调，而亚抑菌浓度双硫仑单独处理则可下调Cdr1表达。在氟康唑与双硫仑联合处理条件下，Cdr1表达水平较氟康唑单独处理组明显降低。该结果从转录水平证实双硫仑逆转氟康唑耐药的关键机制之一在于抑制外排泵基因Cdr1的表达。

（五）分子对接模拟

以Cdr1晶体结构（PDB ID：9IUL）为受体进行分子对接。底物结合腔对接结果显示，氟康唑通过疏水相互作用（Phe552、Leu555、Phe556、Phe559、Leu668、Ile1237、Thr1355）及与Asn1240形成的氢键结合于跨膜结构域（TMD）疏水腔内；双硫仑以类似模式结合于同一区域，与Asn1240形成氢键，且结合亲和力（?6.46 kcal/mol）高于氟康唑（?6.07 kcal/mol），提示其可竞争性抑制氟康唑与Cdr1的结合。ATP结合位点对接结果显示，双硫仑与Walker A基序中Cys193、Thr195、Gly190、Ser194、Gly192等关键残基形成氢键，其结合模式与ATP类似，但亲和力（?5.43 kcal/mol）低于ATP（?6.95 kcal/mol），提示双硫仑可能通过竞争ATP结合干扰ATP水解和外排泵能量供给。

（六）生物膜抑制与清除活性

双硫仑在亚抑菌浓度（1/2、1/4、1/8、1/16 MIC）下对白念珠菌生物膜形成具有剂量依赖性抑制作用，同时对成熟生物膜也表现出显著的清除能力。即使在1/16 MIC的最低测试浓度下，双硫仑仍可使生物膜形成和成熟生物膜清除率降低约14%–37%，显示出较强的抗生物膜潜力。

四、讨论与结论

本研究表明，双硫仑与氟康唑联用对临床氟康唑耐药白念珠菌分离株以协同作用为主，其机制涉及双重层面：一方面，双硫仑通过转录下调Cdr1外排泵基因表达，减少药物外排；另一方面，双硫仑在底物结合腔与氟康唑竞争结合位点，在ATP结合位点与ATP竞争结合并干扰关键残基功能，从而在蛋白功能层面直接抑制外排泵活性。此外，双硫仑还表现出独立的抗生物膜活性，可抑制生物膜形成并清除已成熟的生物膜。既往研究已报道双硫仑对多种耐药细菌和念珠菌具有抑制作用，且其对Cdr1的抑制涉及NBD保守半胱氨酸残基的二硫键形成、竞争性阻断ATP结合及干扰TMD底物结合等多种机制，本研究结果与之一致。尽管研究证实双硫仑可下调Cdr1表达，但其具体转录调控通路和是否影响Cdr2、Mdr1等其他外排泵仍需进一步研究。本研究存在体外实验的局限性，双硫仑-氟康唑联用的体内药效学、药代动力学特征及安全性尚需动物实验和临床试验验证。总之，该研究为克服白念珠菌氟康唑耐药提供了基于药物再利用策略的新思路，双硫仑有望作为一种有前景的抗真菌辅助剂用于临床联合治疗。论文发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》。