儿科社区人群中产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌持续粪便携带的流行率及危险因素

《International Journal of Medical Microbiology》：Prevalence and risk factors for persistent faecal carriage of extended spectrum beta-lactamase producing Escherichia coli in a paediatric community population

　　

摘要

背景：产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌（ESBL-Ec）在社区环境中的粪便携带率正在上升。目前尚缺乏关于儿科社区人群ESBL-Ec持续粪便携带的流行病学数据。本研究旨在确定法国儿科社区人群中同一ESBL-Ec克隆持续粪便携带（超过3个月）的比例，并识别与此持续性相关的临床和微生物学危险因素。

方法：研究对象为2010年10月至2022年8月期间纳入的3至24月龄儿童。在常规就诊时采集直肠拭子（首次就诊，V1），并在3至24个月后的第二次常规就诊（V2）时对V1样本中检测到产ESBL肠杆菌的儿童进行再次采样。对V1和V2分离株进行全基因组测序（WGS）。将V2时携带同一克隆（定义为核心基因组多位点序列分型（cgMLST）的HC20或更低层级且单核苷酸多态性（SNP）差异小于25个）的儿童与V2时ESBL-Ec检测阴性的儿童进行比较。研究人员进行了基于知识的定向统计分析以及全基因组关联研究（GWAS）。

结果：共纳入142名V1时携带ESBL-Ec的儿童。其中，31名（21.8%）儿童在至少3个月内持续携带同一ESBL-Ec克隆。在随访时间超过6个月的儿童中，这一比例为18.4%（16/99）。持续携带组中系统发育组B2（71%对32.6%，p<0.001）和序列类型131（ST-131）（54.8%对27.4%，p<0.001）的占比显著更高。多因素分析显示，在总体人群中，senB（比值比（OR）=4.1，p=0.009）和tia样基因（OR=4.4，p=0.018）与持续携带独立相关。在非ST-131亚组中，senB（OR=16.5，p<0.001）和papC（OR=10.1，p=0.006）与持续克隆显著相关。在ST-131亚组中，papC/papGII（OR=6.2，p=0.042）和tia样基因与持续克隆相关。GWAS分析发现一个与果糖代谢相关的frz操纵子在持续克隆中显著富集。研究人员未发现任何临床因素与持续携带显著相关。

结论：本研究首次报道了21.8%的社区婴幼儿在至少3个月的时间内持续粪便携带同一ESBL-Ec克隆。持续携带与菌株的基因组特征显著相关，特别是系统发育背景B2/ST-131及其相关毒力基因。这些发现提示有必要进一步研究持续携带与婴幼儿发热性尿路感染（FUTI）风险之间的关系。

论文解读：儿科社区人群中产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌持续粪便携带的流行病学与基因组学特征研究

一、研究背景与问题

产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌（extended spectrum beta-lactamase producing *Escherichia coli*, ESBL-Ec）在全球范围内的粪便携带率及尿路感染（urinary tract infection, UTI）发生率呈快速上升趋势，已成为全球性的公共卫生关切。自21世纪初以来，社区环境中ESBL-Ec粪便携带率已从2005年之前的不足5%攀升至2018年的超过20%[^1]。在欧洲地区，这一比率相对较低，但法国儿科社区人群中ESBL-Ec粪便携带率在2015年即已达到10.2%[^2]。此前的持续携带研究主要集中于成人患者，包括住院后[^3]、境外旅行后[^4]的携带情况，而针对社区儿科人群的持续携带研究极为匮乏。考虑到婴幼儿肠道菌群的组成与较大儿童及成人存在显著差异[^5]，开展针对婴幼儿群体的专门研究具有重要的流行病学意义。

二、研究目的

本研究旨在实现两个核心目标：第一，确定法国儿科社区人群中ESBL-Ec持续粪便携带（即同一克隆携带超过3个月）的比例；第二，识别与这种持续性相关的临床及微生物学危险因素。

三、关键技术方法

研究人员依托ACTIV社区儿科医生网络开展了一项自2010年10月至2022年8月的辅助性研究，对3至24月龄儿童进行直肠拭子采样。V1阳性患者间隔3至24个月后进行V2采样。所有分离株均进行全基因组测序（whole genome sequencing, WGS），并通过Centre for Genomic Epidemiology（CGE）和Enterobase数据库进行基因组特征分析。持续克隆定义为V1和V2菌株属于相同HC20（或更低层级）且单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）差异小于25个。统计方法上，研究人员首先进行基于知识的定向分析，采用χ2检验或Fisher精确检验进行双变量分析，logistic回归进行多因素分析；随后使用scoary（v1.6.16）和panaroo进行全基因组关联研究（genome wide association study, GWAS）；此外还使用R软件的icenReg包进行了区间删失数据的生存分析。

四、研究结果

1. 研究人群特征

2010年至2022年间，4641名V1采样儿童中375名（8.1%）携带产ESBL肠杆菌，其中142名儿童纳入最终分析。V2时47名（33.1%）仍携带产ESBL肠杆菌，95名（66.9%）转为阴性。持续携带比例在总体人群中为21.8%（31/142），随访超过6个月的儿童中为18.4%，超过12个月为8.8%。

2. 基因组标准定义持续克隆

通过SNP计数和cgMLST层级聚类（hierarchical clustering, HC）分析，研究人员发现了两个明显分离的群体：31名患者V1和V2菌株间SNP差异小于25个且HC20或更低，被归类为持续携带组V2(+)PER；16名患者SNP差异超过3200个且HC100或更高，被归类为不同克隆组V2(+)DIFF。两组在V1和V2间时间间隔上无统计学显著差异。

3. 临床数据分析

双变量分析未发现V2(-)组与V2(+)PER组在性别、年龄、照护方式、兄弟姐妹情况、V1前6个月抗生素使用、住院或境外旅行方面存在显著差异。这一结果与成人研究不同，可能与临床数据仅在V1时点收集、随访期间变量可能发生变化有关。

4. 系统发育组和序列类型分布

系统发育组B2在V2(+)PER组中显著富集（71%对32.6%，p<0.001）。ST-131在V2(+)PER组中的比例为54.8%，显著高于V2(-)组的27.4%（p<0.001）。生存分析显示B2系统发育组（p=0.015）和ST-131（p=0.006）单独均能显著增加菌株的持续存活概率，但由于ST-131在B2菌株中占比高达81.1%，两者效应无法在统计上区分。值得注意的是，A、B1和C系统发育组中未发现任何持续克隆。

5. 基于知识的定向统计分析

在总体人群中，多因素分析显示仅senB（OR=4.1，p=0.009）和tia样基因（OR=4.4，p=0.018）与持续携带显著相关。非ST-131亚组中，senB（OR=16.5，p<0.001）和papC（OR=10.1，p=0.006）显著相关。ST-131亚组中，papC/papGII（OR=6.2，p=0.042）和tia样基因与持续克隆相关。

6. 非靶向GWAS分析

GWAS分析发现8个基因在持续克隆中显著富集（94%对48%），这些基因经过Bonferroni和Benjamini校正后仍保持显著。这些基因在基因组上连续排列，属于同一操纵子，与已报道的frz操纵子高度同源。该操纵子编码磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统（phosphotransferase system, PTS）果糖亚家族转运蛋白的三个亚基、PTS转录激活因子、两个II型酮糖-1,6-二磷酸醛缩酶、一个糖特异性激酶及一个cupin超家族蛋白。frz操纵子在B2、D、E和F系统发育组的持续克隆中分布广泛，但不存在于A系统发育组。

7. 系统发育连锁分析

最大似然（maximum likelihood, ML）系统发育树显示，4株O16:H5 ST131持续克隆在系统发育上紧密连锁，与非持续O16:H5 ST131克隆明显分离。所有持续的O16:H5 ST131克隆均携带papC和papGII基因，且4株中2株携带tia样基因，而5株非持续的O16:H5 ST131克隆均不携带这些基因。非ST-131持续克隆则未发现明显的系统发育连锁关系。

8. tia样和senB基因的遗传环境

在9株携带tia样基因的持续菌株中，6株（66.7%）的tia样基因与papGII共定位，其中包括5株ST-131菌株；而10株非持续菌株中仅1株（10%）存在共定位，差异显著（p=0.019）。所有senB基因均与cjrABC共定位，这一组合提示存在类似pUTI89的质粒，该质粒与肠外致病性大肠埃希菌（extraintestinal pathogenic *E. coli*, ExPEC）的泌尿道致病性相关。

五、讨论与结论

本研究依托一个超过4500名健康儿童、历时12年的前瞻性队列，通过系统测序首次确立了21.8%的社区定植儿童在至少3个月内持续粪便携带同一ESBL-Ec克隆，18.4%持续至少6个月。与既往成人研究相比，本研究未发现临床因素对持续携带的显著影响。系统发育组B2和ST-131在持续携带中占主导地位，但由于二者高度共线无法区分独立效应。在毒力基因方面，senB编码的肠毒素和tia样基因编码的黏附侵袭相关蛋白分别被证实与非ST-131和ST-131克隆的持续携带相关，papC/papGII编码的肾盂肾炎相关菌毛也在ST-131亚组中被确认为独立危险因素。GWAS发现的frz代谢操纵子与ExPEC高度相关，参与1型菌毛表达的调控并促进细菌在应激条件下的适应性[^6]。这些发现共同提示，肠外毒力基因在肠道定植中赋予菌株选择优势，肠外毒力可能是共生适应的偶然副产物。研究结论明确指出，系统发育组A和B1的克隆无法持续定植，而B2和ST-131在持续携带中发挥重要作用；黏附素（tia、papC和papGII）、毒素（senB）及frz碳水化合物代谢操纵子的具体作用机制仍需功能学研究进一步验证。这些发现为婴幼儿发热性尿路感染（febrile urinary tract infection, FUTI）风险的后续研究提供了重要方向。研究局限性包括V1至V2间时间间隔的异质性、相对有限的样本量以及辅助性研究设计对因果推断的限制。

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[^1]: Bezabih YM, et al. 2021. [^2]: Birgy A, et al. 2016. [^3]: Titelman E, et al. 2014. [^4]: Ruppé E, et al. 2015. [^5]: Yatsunenko T, et al. 2012. [^6]: Rouquet G, et al. 2009.