ST11-K64高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌共携带blaKPC-2与blaNDM-13的基因组特征及医院相关性克隆传播分析

《International Journal of Medical Microbiology》：Genomic characteristics and hospital-associated clonal transmission analysis of ST11-K64 hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae co-harboring bla KPC-2 and bla NDM-13

　　

**摘要**

**目的**：本研究旨在表征bla_KPC-2与bla_NDM-13基因在ST11-K64碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）中的共存特征，并重点分析该克隆菌株引起的医院相关性克隆传播。

**方法**：采用聚合酶链反应（PCR）和Sanger测序确定耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CRKP）分离株的多位点序列分型（MLST）、血清型及碳青霉烯酶基因。评估临床数据、抗菌药物敏感性、质粒接合转移及生长曲线。通过血清杀菌试验、生物被膜形成试验和Galleria mellonella感染模型评估毒力。对代表性菌株进行全基因组测序，并利用生物信息学工具进行基因组分析。

**结果**：在2023年2月至2024年5月期间，研究人员从中国黑龙江省某三甲医院连续收集77株广泛耐药CRKP分离株，鉴定出6株共携带KPC-2和NDM-13的CRKP菌株，均属于ST11-K64型。结合临床数据分析和核心基因组单核苷酸多态性（SNP）分析表明，这些ST11-K64菌株导致了一起医院内暴发。全基因组测序揭示该克隆谱系携带一个含bla_KPC-2的IncFII/IncR质粒和一个携带bla_NDM-13的IncI1质粒。与既往研究一致，bla_KPC-2基因定位于非Tn4401元件（NTE_KPC），而bla_NDM-13的遗传环境呈现出bla_NDM遗传背景的常见特征：△ISAba125-bla_NDM-ble_MBL。该克隆菌株还含有一个pLVPK样毒力质粒，其上毒力基因以iucA-rmpA-rmpA2-peg-344组合形式存在。根据广泛采用的基因组标准，携带iuc和/或rmpA/rmpA2的CRKP分离株被定义为CR-hvKP。因此，该克隆菌株被归类为CR-hvKP。

**结论**：肺炎克雷伯菌中NDM-13与KPC-2共表达极为罕见，此前仅有一例报道。该特殊菌株还表现出区域内及跨区域传播的潜力。这种兼具高毒力潜力的多重耐药菌株的出现构成重大全球健康威胁，亟需采取紧急行动。

**论文解读：ST11-K64 KPC-2_NDM-13碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌的基因组特征与医院克隆传播**

**一、研究背景与目的**

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CRKP）因多重耐药导致临床有效抗菌治疗策略匮乏，已被世界卫生组织列为重大临床威胁病原体。高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）通常对常用临床抗生素敏感，但可引起化脓性肝脓肿、眼内炎和脑膜炎等致命感染，具有高发病率和死亡率。既往认为碳青霉烯耐药与高毒力是非重叠表型，然而两者已发生融合，碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）的出现对临床治疗和公共卫生构成重大挑战。在中国，CRKP的播散主要归因于质粒介导的碳青霉烯酶基因水平转移，包括肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）和新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）。KPC-2是全球最常见的KPC亚型，NDM-1和NDM-5是最常见的NDM类型。NDM-13是2015年首次在尼泊尔发现的NDM新变异体，与NDM-1相比含两个氨基酸替换（D95N和M154L），增强了对头孢噻肟的水解活性。与NDM-1和NDM-5相比，NDM-13的报道相对稀缺。虽然多数研究聚焦于单独携带KPC或NDM的CRKP，但共携带KPC和NDM的CRKP菌株正在增多，这类菌株可导致新型碳青霉烯酶抑制剂组合如头孢他啶-阿维巴坦（CZA）治疗失败，双重酶介导的耐药机制赋予肺炎克雷伯菌更广谱、更高水平的耐药性，极大限制了临床抗生素选择。本研究报道了同一医院短期内连续分离的6株共携带bla_KPC-2和bla_NDM-13的CRKP菌株引起的医院相关性克隆传播事件，并对其生物学特征和基因组图谱进行详细表征。

**二、主要关键技术方法**

研究人员从中国黑龙江省哈尔滨市某三甲医院在2023年2月至2024年5月间连续收集77株CRKP分离株，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定菌种。采用PCR和Sanger测序进行多位点序列分型（MLST）、荚膜血清分型和碳青霉烯酶基因检测。通过Vitek2 Compact系统和E-test法测定抗菌药物最小抑菌浓度（MIC）。毒力评估采用血清杀菌试验、生物被膜形成试验和Galleria mellonella幼虫感染模型。全基因组测序利用Illumina HiSeq 2500和PacBio Sequel IIe平台，通过Flye组装、Prodigal和GeneMarkS注释，使用CARD、VFDB、ISEScan、Kleborate、ABRicate等工具进行耐药基因、毒力基因和插入序列分析，基于核心基因组SNP构建最大似然系统发育树。质粒接合转移试验以大肠杆菌EC600为受体菌，并通过生长曲线评估适应性代价。

**三、研究结果**

**3.1 医院感染暴发的流行病学概述**

在77株CRKP中鉴定出6株ST11-K64 KPC-2_NDM-13 CRKP菌株，分离自两个医院院区的6名患者。首株KPN65于2023年5月分离自A院区ICU，约6个月后其他病例相继出现。患者分布在ICU、胸外科、普外科、消化内科、神经外科、呼吸内科等多个病房，时空分布呈聚集性，提示存在跨病房传播或共同暴露。尽管给予积极抗菌治疗，患者生存率仅33.3%。

**3.2 ST11-K64 KPC-2_NDM-13 CR-hvKP的基因组特征与系统发育分析**

全基因组测序显示，首株KPN65含一个环状染色体和5个质粒，其余5株含4个质粒。KP79、KP90、KP91缺失ColRNAI质粒，KP120和KP136缺失IncFII质粒。所有菌株毒力评分4分，耐药评分2分。以参考基因组K56649为参考，核心基因组SNP分析鉴定出22个多态位点，表明ST11-K64肺炎克雷伯菌克隆传播。两两比较的SNP距离为0-15个SNP，以10个SNP为操作阈值，KP79、KP90、KP91和KPN65构成一个紧密相关亚群（0-7 SNPs），KP120和KP136构成另一个亚群（2 SNPs），系统发育树支持这一分群。

**3.3 抗菌药物耐药与毒力表达**

所有菌株对测试的β-内酰胺类（头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶/阿维巴坦）、碳青霉烯类（美罗培南、亚胺培南、厄他培南）和氟喹诺酮类（左氧氟沙星、环丙沙星）均高度耐药，对四环素类和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑呈不同程度耐药，但对多黏菌素和替加环素敏感（KP90对替加环素中介）。血清杀菌试验显示所有菌株比ATCC700603显著抵抗补体杀伤，但低于NTUH-K2044。生物被膜试验仅KP120表现出强生物被膜形成能力。在Galleria mellonella感染模型中，感染菌株的幼虫死亡率与高毒力对照NTUH-K2044相当。

**3.4 毒力分子分析**

全基因组测序显示所有菌株染色体携带Ⅰ型菌毛（fimABCDEFGHIK）、Ⅲ型菌毛（mrkABCDFHIJ）、铁获取系统（entABCDEFS、fepABCDG）、Ⅵ型分泌系统（T6SS）及生物被膜、黏附、免疫逃逸相关基因。所有菌株含repB/IncHI1B型毒力质粒，携带与pLVPK和pK2044高度同源的毒力基因，包括rmpA、rmpA2、iutA、iucABCD、peg-344及银/碲耐药基因sil和ter。与经典毒力质粒相比，rmpA基因在第46-47位核苷酸处被插入序列ISKpn26插入失活，导致移码突变并使翻译提前终止，完全缺失HTH_LUXR型DNA结合域。

**3.5 抗菌药物耐药分子分析**

所有菌株携带多种β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和磺胺类耐药基因。KPN65、KP79、KP90、KP91因携带IncFII质粒而具有更广耐药谱，该质粒含qnrS1、sul2、tet(A)、dfrA14和bla_LAP-2等耐药基因。

**3.6 bla_KPC-2遗传环境的比较基因组分析**

bla_KPC-2基因位于IncFII/IncR型质粒上，与CRKP_41质粒高度相似。该基因位于非Tn4401元件（NTE_KPC），因上游未检测到bla_TEM或Tn5563/IS6100插入，归类为NTE_KPC-I组，具体结构与pKPHS2中的NTE_KPC-Ib一致。但本研究中经典的Tn1721和Tn4653元件被IS26插入元件替代。

**3.7 bla_NDM-13遗传环境的比较基因组分析**

6个IncI1型质粒与来自肠道沙门菌SR33的pNDM13-SR33质粒同源性最高（>99.9%）。除pCSRM3-NDM13外，所有携带bla_NDM-13的IncI1质粒共享高度保守的遗传环境：△ISAba125-IS1294-△ISAba125-bla_NDM-13-△ble_MBL-trpF。IS1294插入并截短ISAba125。pCSRM3-NDM13额外含有Tn2-IS26片段及复合耐药模块。

**3.8 接合子表征及携带bla_KPC-2/bla_NDM-13质粒转移性验证**

接合实验表明所有野生菌株成功将bla_NDM-13基因转移至受体菌EC600。IncI1型质粒含完整接合转移系统（oriT、松弛酶、T4SS基因簇tra和T4CP基因簇trb），可自主转移；而IncFII/IncR型质粒缺乏松弛酶和T4CP编码基因，不能自主转移。接合子对所有测试β-内酰胺和碳青霉烯类药物的耐药水平与原菌株相当。生长曲线显示质粒转移未增加EC600的适应性代价。

**四、讨论与结论**

本研究报道了6株共产KPC-2和NDM-13的CR-hvKP菌株，并详细描述了其遗传特征。该克隆菌株在院内持续存在并发生隐匿传播，衍生出两个亚克隆（丢失ColRNAI质粒和丢失IncFII质粒）。KP120和KP136因丢失IncFII质粒而缺失dfrA14基因，这解释了它们对甲氧苄啶-磺胺甲噁唑恢复敏感。KP90与KP91间SNP距离为0且住院时间地点重叠，提示属于同一近期传播链；患者4曾在该省不同城市医院治疗，提示跨区域克隆传播或共同暴露。感染患者多有长期住院、多次手术和频繁侵入性操作史，这些是KPC-NDM共携CRKP感染的重要危险因素。

关于耐药基因环境，bla_KPC-2位于NTE_KPC-Ib结构中，Tn1721和Tn4653被IS26替代可能增强bla_KPC-2在菌群中的转移性。bla_NDM-13位于IncI1-I型质粒，其遗传背景符合△ISAba125-bla_NDM-ble_MBL特征，IS1294插入可能在NDM-13 mobilization中起关键作用。与pLWY24J的比较提示IncI1质粒骨架获得bla_NDM-13模块的进化路径；pCSRM3-NDM13含额外模块而后续质粒丢失这些模块，提示从“扩增”到“精简”的进化趋势以降低适应性代价。

毒力方面，所有菌株被定义为CR-hvKP，毒力基因以iucA-rmpA-rmpA2-peg-344组合位于pLVPK样质粒。rmpA被ISKpn26失活可能是菌株在拉丝试验中不表现高黏表型的原因。KP120的强生物被膜表型可能与barA基因的p.Asp350Gly突变有关，但KP136携带相同突变却无此表型，且另有argP基因p.Val55Gly突变，二者互作仍属推测。

2024年的报道首次记录了肺炎克雷伯菌中NDM-13的出现及ST11-K64 KPC-2_NDM-13_CR-hvKP医院暴发，其菌株K56649与本研究的KPN65仅相差4个核心SNP，且患者均来自黑龙江省，提示该克隆可能在同一时期发生了区域性暴发和跨区域传播。

**结论**：本研究报道了6株共产KPC-2和NDM-13的CR-hvKP，其遗传特征已被详细描述。ST11-K64 KPC-2_NDM-13_CR-hvKP兼具高毒力和多重耐药性，具有强大的传播潜力，构成大规模区域性暴发的严重风险，对公共卫生构成重大威胁。因此，必须高度关注这一问题，并采取有效措施进行主动监测和预防，以防止进一步传播和暴发。