猪流行性腹泻病毒S-INDEL亚型的系统发育分歧与分子特征

《Transboundary and Emerging Diseases》：Phylogenetic Divergence and Molecular Signatures of Porcine Epidemic Diarrhea Virus S-INDEL Subtype

　　

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）在疫苗诱导免疫和环境因素的选择压力下持续进化，导致免疫逃逸和仔猪死亡率居高不下。在本研究中，研究人员对2023年至2026年间在中国各地收集的PEDV田间毒株进行了鉴定，观察到显著的遗传分歧。其中，三个毒株被鉴定为S-INDEL亚型，每个毒株位于S-INDEL系统发育树的不同分支上。进一步的分析揭示了分支特异性的分子特征。值得注意的是，位于S-INDEL-CH-1和S-INDEL-CH-2分支上的毒株在S基因的416–418位点携带一个三核苷酸缺失。为了便于快速区分GI基因型内的亚型和S-INDEL亚型，研究人员建立了一个分层分型方案，该方案结合了预测的N-连接糖基化位点多态性（N1193和N230）与S-INDEL特异性缺失模式，从而能够直接从S基因序列中对PEDV GI基因型（GIa和GIb）和S-INDEL亚型进行快速初步区分。总之，研究人员的发现为PEDV GI基因型和S-INDEL亚型分类提供了一个互补且实用的框架，并为S-INDEL亚型的分子特征提供了新的见解。

论文解读：《猪流行性腹泻病毒S-INDEL亚型的系统发育分歧与分子特征》

研究背景

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于α冠状病毒属，是引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）的主要病原体，对全球养猪业造成严重经济损失。PEDV的基因组约为28 kb，编码四种结构蛋白（S、E、M和N）、16种非结构蛋白（nsp1-nsp16）以及一种辅助蛋白（ORF3）。其中，S糖蛋白是主要的毒力因子，包含负责受体结合的N端S1亚基和含有融合元件的C端S2亚基。因此，S基因既是决定毒力差异的遗传变异热点区域，也是PEDV整体遗传多样性的主要贡献者。

PEDV的演化历史经历了多个关键阶段。2010年以前，中国流行的主要是经典的GIa毒株，通过广泛使用基于CV777毒株的灭活和减毒疫苗得以有效控制。然而，2010年10月，中国南方出现了高致病性GIIa变异毒株，其能绕过现有疫苗免疫力，导致接种疫苗农场哺乳仔猪100%死亡。2013年，美国出现了高致病性GIIb毒株，造成全国猪群10%的死亡率并扩散至国际。2014年，在美国和中国分别鉴定出了新的PEDV变异株（OH851和CH/HBQX/10），这些毒株被命名为S-INDEL，推测由经典毒株和新发毒株重组产生。与北美原型毒株相比，S-INDEL毒株在S基因中存在特征性的插入和缺失，包括179位点的1-nt缺失、163–175位点的11-nt缺失、425–427位点的3-nt缺失以及497–502位点的6-nt插入。在田间条件下，S-INDEL毒株引起的腹泻症状较轻，仔猪死亡率也较低。系统发育上，S-INDEL在基因I型内形成一个独特的单系分支，现已被认定为与GIa和GIb并列的GI亚型。

尽管持续部署针对GI和GII毒株的商业疫苗，中国近期的监测数据显示PEDV的流行率和发病率依然居高不下，表明该病毒仍是养猪业面临的严峻挑战。因此，深入研究PEDV的遗传多样性、进化动态以及开发更精细的分型工具对于疫情监控和防控策略的制定至关重要。

研究方法

本研究采用了多种关键技术方法。首先，研究人员于2023年至2026年从中国11个省份采集了25份经RT-qPCR确认为PEDV阳性的临床样本（包括肠道组织、粪便拭子和粪便），并由北京中科基因技术股份有限公司进行测序。其次，利用MAFFT v7.505软件进行核苷酸和氨基酸序列比对，使用MEGAX软件中的最大复合似然模型计算遗传距离（p-distance），并通过NetNGlyc-1.0服务器（阈值0.5）预测潜在的N-连接糖基化位点。第三，采用IQ-TREE v3.1.2软件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树，并使用1000次bootstrap重复评估分支支持度。第四，利用SWISS-MODEL同源建模服务器，以PEDV刺突蛋白（PDB ID: 7w73.1）为模板，预测S蛋白的三级结构，并使用PyMOL软件进行可视化和比较分析。

研究结果

3.1. 本研究中PEDV临床样本的背景信息

从2023年到2026年，共从全国11个省份收集了25份PEDV阳性临床样本。采样时间分布显示，虽然跨越多季节，但高峰期集中在冬季和早春，这与已知的PEDV暴发季节性模式一致。

3.2. 基于PEDV毒株S基因的系统发育特征

通过对S基因的系统发育分析，揭示了不同的基因型分布。GIIc是主要谱系（56%，13/25），其次是GIIb（24%，8/25）和S-INDEL（12%，3/25），这表明中国流行的PEDV正从GIIa向GIIc发生区域性转变。值得注意的是，S-INDEL亚型的毒株分布在系统发育树的两个主要分支上。进一步的S-INDEL亚型单独系统发育树显示，该基因型分化为两个独立分支：一个包含来自美国、韩国、法国和中国（2016年前）毒株的S-INDEL-1分支（S基因长度均为4152 bp），以及两个仅包含2020年后中国毒株的分支——S-INDEL-CH-1（S基因长度为4149或4152 bp）和S-INDEL-CH-2（S基因长度均为4149 bp）。

3.3. PEDV各基因型间遗传距离和进化速率的比较分析

全基因组水平的分析显示，S-INDEL亚型表现出极高的平均p-distance（0.3809），约为其他基因型的25倍，反映了其显著的基因组可塑性。在S基因水平，S-INDEL亚型同样显示出最高的平均遗传分歧（0.0254）。此外，根到尖回归分析表明，S-INDEL亚型的进化速率最快（3.63 × 10^-3 substitutions/site/year），且具有很强的时间信号（R² = 0.7503），而GIIa和GIa则表现出较弱的时间信号。

3.4. PEDV临床毒株S蛋白氨基酸差异分析

通过与代表不同基因型的参考毒株（GIa疫苗株CV777、GIIb流行株AJ1102和GIIc参考株CH/HNAY/2015）进行比较，发现氨基酸变异主要集中在S1亚基的D0和NTD结构域。主要的 neutralizing epitopes（中和表位）COE、SS2、SS6、2C10和S1A在S-INDEL和GII之间100%保守，替换仅限于N端的S10/D0表位。S-INDEL与GII的S蛋白之间存在29个氨基酸替换，其中26个局限于D0结构域（aa 34–234）。S-INDEL亚型与GIIc的氨基酸相似性最高（95.9%）。

3.5. PEDV S-INDEL毒株S基因缺失和插入模式分析

所有S-INDEL毒株均携带特征性的缺失/插入模式。特别地，S-INDEL-CH-1/CH-2毒株在S基因的416–418位点存在一个额外的三核苷酸缺失（GTT/GUU），导致氨基酸基序变为“PSSG”。三维建模显示，这一缺失改变了S1蛋白顶部的表面结构。

3.6. PEDV GI基因型糖基化模式分析

对GI基因型（GIa、GIb、S-INDEL）的N-糖基化位点分析揭示，N1193和N230位点呈现独特的多态性模式。基于此，研究人员建立了一个层级决策树：首先，GIa因缺乏N1193（0%）可与其它亚型区分；其次，在N1193阳性菌株中，S-INDEL-CH-1/CH-2因几乎完全缺乏N230（分别为3%和4%）而与GIb和S-INDEL-1区分；最后，通过138位和246位的氨基酸标记物（GIb为138 aa = T，S-INDEL-1为138 aa = Δ；S-INDEL-CH-1为246 aa = Y，S-INDEL-CH-2为246 aa = H）进行最终区分。

讨论与结论

讨论部分指出，PEDV仍然是影响全球养猪业健康发展的重大问题。尽管疫苗接种是主要防控手段，但由于S蛋白的高度变异性，现有疫苗无法对新出现的强毒株提供完全保护。本研究发现GIIc基因型仍占主导地位（56%），但同时检测到三种S-INDEL亚型毒株（12%），且它们位于三个不同的系统发育分支上。研究进一步分析了S-INDEL分支的背景信息，发现S-INDEL-1分支主要由早期国内外分离的毒株组成，而S-INDEL-CH-1和S-INDEL-CH-2分支则包含了2020年以来新出现的中国特有S-INDEL毒株。S-INDEL-CH-1/CH-2亚型相较于经典S-INDEL毒株OH851，多出一个位于416–418位的三核苷酸缺失，这可能导致S1蛋白表面拓扑结构改变，可能代表了一种新的突变模式。通过比较遗传分歧和进化速率，发现S-INDEL亚型具有最高的遗传分歧和最快的进化速率，因此对其流行动态的监测至关重要。

研究的局限性包括：2023-2026年的全基因组PEDV样本量和省份覆盖有限，可能无法全面反映中国PEDV流行病学全貌；关于S-INDEL-CH-1/CH-2亚型中416–418位三核苷酸缺失的功能分析仅限于三维建模，缺乏细胞或仔猪模型的实验验证；基于糖基化的分型方案旨在作为快速筛查工具，其在新出现变异株上的表现需要持续评估。

研究结论：总之，本研究在S-INDEL-CH-1/CH-2亚簇的S基因中发现了一个三核苷酸缺失，进一步强调了这一进化活跃谱系的持续多样化。此外，研究人员建立了一个分层分型方案，该方案结合了预测的N-连接糖基化位点多态性（N1193和N230）与S-INDEL特异性缺失模式，从而能够直接从S基因序列中对PEDV GI基因型（GIa和GIb）和S-INDEL亚型进行快速初步区分。该方法为大规模分子监测中的初步基因型筛选提供了实用工具，补充而非替代全面的系统发育分析。这些发现拓展了当前的PEDV基因分型框架，并为监测GI基因型和S-INDEL亚型的进化提供了可行的分子标记。