高HBV抗原水平随时间驱动携带小鼠疫苗诱导的CD8+ T细胞功能丧失

《JHEP Reports》：High HBV antigen levels drive loss of vaccine-induced CD8+ T-cell function in carrier mice over time

　　

摘要

背景与目的
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染因病毒特异性CD8⁺ T细胞功能失调而持续存在。高HBV抗原水平损害治疗性疫苗接种的成功率。病毒滴度对疫苗诱导免疫的影响仍有待充分阐明。研究人员比较了低滴度与高滴度HBV携带小鼠中疫苗应答的动力学，以识别临界时间点并解析决定治疗性疫苗接种结局的关键步骤。

方法
研究人员使用腺相关病毒（AAV）-HBV在免疫活性C57BL/6J小鼠肝脏中建立低滴度与高滴度持续性HBV复制，并施用TherVacB（一种异源蛋白初免-改良痘苗病毒Ankara加强疫苗）。在疫苗接种期间及随后纵向收集血清和肝脏样本，以分析HBV特异性免疫应答及病毒参数。

结果
疫苗接种前的HBV抗原水平对anti-HBs应答无显著影响（p>0.9）；然而，其对疫苗诱导的CD8 T细胞应答具有显著影响。TherVacB诱导的、活化的核心特异性CD8⁺ T细胞在低滴度与高滴度HBV携带者中均能高效浸润肝脏。低滴度HBV携带小鼠实现持续病毒清除和记忆T细胞形成，而高滴度小鼠仅表现出短暂病毒降低，随后出现CD8⁺ T细胞功能障碍并未能清除感染。HBV感染的持续存在及持续暴露于高抗原水平导致耗竭标志物（如PD-1和TOX）过表达（p<0.01），以及共刺激受体4-1BB过表达（p<0.01）。核心特异性CD8⁺ T细胞被困于肝脏中，逐渐丧失效应功能，最终被清除。

结论
这些发现确定了影响疫苗诱导CD8 T细胞应答的关键时间点，提示早期干预靶向T细胞功能障碍可能增强慢性HBV感染中治疗性疫苗接种的疗效。

影响与意义
本研究证明，基线HBV抗原载量关键性地决定疫苗诱导的CD8⁺ T细胞免疫的持久性。尽管治疗性疫苗接种最初无论病毒滴度高低均能诱导肝脏浸润性HBV特异性CD8⁺ T细胞，但仅低滴度感染允许持续的病毒清除和记忆T细胞形成。在高滴度HBV携带者中，持续抗原暴露驱动进行性T细胞耗竭和清除，导致短暂病毒控制和治疗失败。重要的是，数据确定了一个关键时间窗口，在此窗口中早期干预以预防或逆转T细胞功能障碍可能是决定性的。在临床上，这些发现支持将治疗性疫苗接种与早期应用的抗原降低或免疫调节策略相结合，以在慢性HBV感染中实现持久的免疫控制。

论文解读：高HBV抗原载量驱动治疗性疫苗诱导的CD8⁺ T细胞功能丧失的时间动力学研究

一、研究背景与目的

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染影响全球2.54亿人，与HBV相关肝硬化和肝细胞癌的高风险相关，每年导致110万人死亡。目前聚乙二醇干扰素-α或核苷（酸）类似物等治疗方法在许多患者中不适用或很少实现HBV治愈。慢性HBV感染与先天性和适应性免疫的激活不足相关，导致病毒特异性CD8⁺ T细胞缺乏和功能障碍，无法清除感染的肝细胞。相比之下，急性HBV感染通过有效的、多特异性病毒特异性CD8 T细胞应答得以解决。因此，通过强效治疗性疫苗激活患者免疫系统以控制慢性HBV感染是实现HBV治愈的有前景策略。

研究人员开发了治疗性乙型肝炎疫苗TherVacB，采用异源蛋白初免-重组改良痘苗病毒Ankara（MVA）加强方案，目前正在临床试验中评估。在低至中等HBV水平的临床前小鼠模型中，TherVacB诱导了强效HBV特异性免疫应答和HBV长期免疫控制。然而，高水平的HBV抗原损害了疫苗诱导的HBV特异性CD8 T细胞应答和抗病毒疗效。使用靶向HBV的siRNA降低HBV抗原水平可改善疫苗疗效，表明低抗原水平是有效CD8 T细胞应答和病毒清除所必需的。后续研究表明，肝脏中表达的抗原水平而非循环抗原水平对T细胞功能起决定性作用。然而，在临床研究中，siRNA介导的HBV降低单独对恢复HBV特异性免疫的效果有限，提示高滴度HBV携带者中还存在导致疫苗无应答的其他机制。本研究旨在纵向比较低滴度与高滴度HBV携带小鼠中治疗性疫苗接种诱导的抗病毒免疫应答，特别关注肝脏相关的病毒特异性CD8 T细胞应答，以识别影响疫苗疗效的临界时间点并解析决定治疗性疫苗接种结局的关键步骤。

二、关键技术方法

研究人员建立了低滴度与高滴度持续性HBV复制小鼠模型：向免疫活性C57BL/6J小鼠（8-10周龄雄性，购自Janvier Labs，法国）尾静脉注射2×10⁹或1×10¹⁰基因组当量（GE）的AAV-HBV1.2载体（编码基因D型1.2倍超长HBV基因组），6周后建立持续性HBV复制。低滴度小鼠基线HBsAg为133.9（±69.7）IU/mL，高滴度小鼠为1093.8（±665.2）IU/mL。疫苗接种方案为：第0周和第2周肌肉注射由HBV S（基因A型）和核心（基因D型）蛋白组成的病毒样颗粒（VLP）各10μg，并以10μg c-di-AMP作为佐剂；第4周肌肉注射3×10⁷感染单位（IFU）的表达相应HBV-S和核心蛋白的重组MVA（MVA-S、MVA-core）进行加强免疫。研究在接种前（第0周）、接种期间（第2、3周）以及完成疫苗接种方案后的早期（第5周）和晚期（第8、12、18周）进行纵向分析。主要技术包括：MHC I类多聚体染色检测HBV特异性CD8⁺ T细胞（C93和S190多聚体）、流式细胞术分析免疫细胞亚群及表型标志物、细胞内细胞因子染色（ICS）检测IFNγ、TNF和颗粒酶B（GzmB）产生、血清学指标检测（HBsAg、HBeAg、anti-HBs、anti-HBe、anti-HBc、ALT）、肝脏组织学分析（H&E染色、免疫组化、Desmet炎症评分）、肝内HBV-DNA和pgRNA定量PCR检测、以及基于HepG2-NTCP细胞的HBV中和试验。

三、研究结果

1. 高HBV滴度阻止治疗性疫苗接种后HBsAg和HBeAg血清清除
每次疫苗接种后，低滴度和高滴度小鼠的抗原水平均下降，在第5周（即MVA加强后一周）达到最低值。低滴度HBV携带者中HBsAg此后维持在检测限以下，而高滴度小鼠中HBsAg水平迅速反弹，第18周时仅比基线低1个log10。两组间诱导的anti-HBs抗体量相当。中和试验显示，第3周时低滴度小鼠血清的HBV中和能力约为高滴度小鼠的5倍，但该差异在第5周和第18周未持续。anti-HBc抗体在第二次蛋白疫苗接种后（第3周）首次检出。低滴度小鼠在第二次蛋白疫苗接种后即发生anti-HBe血清转换，MVA加强后HBeAg降至检测限以下，此前出现短暂血清丙氨酸氨基转移酶（sALT）升高，表明HBV阳性肝细胞被清除。高滴度小鼠除第2周外未检测到ALT明显升高。

2. 高HBV滴度阻止治疗性疫苗接种后感染肝细胞的有效清除
两组小鼠在TherVacB疫苗接种后均观察到肝实质免疫细胞浸润，但仅检测到轻微或轻度炎症，无显著组织病理学改变。低滴度小鼠核心阳性肝细胞数量在疫苗接种过程中逐渐减少，完成全部TherVacB方案后转为阴性；高滴度小鼠HBV阳性肝细胞数量在整个监测期间保持高水平。TherVacB最终在第18周使低滴度小鼠肝内HBV-DNA和前基因组RNA（pgRNA）清除。高滴度小鼠肝内HBV-DNA和pgRNA在第2周下降，但最终在第18周几乎反弹至起始水平。

3. 治疗性疫苗接种触发淋巴细胞浸润肝脏
在建立低和高滴度持续性HBV复制6周后（第0周），两组小鼠脾脏和肝脏中B细胞、CD4⁺和CD8⁺ T细胞及NK细胞数量无显著差异。完成TherVacB方案后一周（第5周），所有检测的效应细胞群数量均大幅增加，与初始感染水平无关。高滴度小鼠在第5周脾脏CD8⁺ T细胞和NK细胞数量较高，第18周肝脏B细胞数量较高；低滴度小鼠第5周肝脏NK细胞数量显著增加。两组间脾脏或肝内调节性T细胞（Tregs）数量在任何检测时间点均无差异，提示Tregs不太可能限制高滴度AAV-HBV小鼠中TherVacB的疗效。

4. 疫苗诱导的HBV特异性CD8⁺ T细胞根据初始HBV水平经历不同命运
在肝脏中，低滴度和高滴度HBV携带者的C93特异性CD8⁺ T细胞数量在每次蛋白免疫后均稳步增加，第2、3周数量相当。低滴度携带者中，肝内C93特异性CD8⁺ T细胞在MVA加强后强力扩增，第5周达到峰值；HBV清除后收缩但随后稳定。高滴度携带者中，C93特异性CD8⁺ T细胞在MVA加强后未进一步扩增，而是逐渐减少，第18周几乎检测不到。低滴度携带者脾脏中第5周开始可检测到C93特异性CD8⁺ T细胞，与持续性HBV感染的清除相关；高滴度携带者脾脏中任何时间点均未检测到C93特异性CD8⁺ T细胞。MVA特异性CD8⁺ T细胞数量在两组间相当，表明观察到的差异严格为HBV特异性。S190特异性CD8 T细胞仅在完整疫苗接种方案后（第5周）在两组中检测到，数量显著低于C93特异性细胞，且两组间差异较小。高滴度携带者肝脏中Cxcr6⁺ C93特异性CD8⁺ T细胞比例和Cxcr6每细胞表达水平（MFI）均显著高于低滴度携带者。几乎所有TherVacB诱导的C93特异性CD8⁺ T细胞均呈效应/效应记忆表型（CD44⁺CD62L^-），多数共表达Cxcr6和CD44，特别是在高滴度小鼠中，表明疫苗接种后活化肝脏驻留CD8⁺ T细胞富集。低滴度携带者清除HBV后，脾脏中C93特异性CD8⁺ T细胞最初呈效应记忆表型，但中央记忆T细胞比例稳步增加。

5. 高滴度HBV携带者的疫苗诱导HBV特异性CD8⁺ T细胞随时间丧失效应功能
第2周和第3周，低滴度和高滴度小鼠肝脏中均可检测到低但相当数量的核心特异性IFNγ⁺、TNF⁺和GzmB⁺ CD8⁺ T细胞。第5周加强疫苗接种后，低滴度小鼠IFNγ⁺ CD8⁺ T细胞数量达到峰值；高滴度小鼠功能性核心特异性CD8⁺ T细胞数量减少并在后续时间点检测不到。低滴度携带者第5周后脾脏中出现强效多功能核心特异性CD8 T细胞应答。低滴度小鼠表现出短暂的效应S特异性CD8 T细胞应答，但水平显著低于核心特异性应答；高滴度携带者肝脏或脾脏中始终未检测到功能性TherVacB诱导的S特异性CD8⁺ T细胞。

6. TherVacB诱导的HBV特异性CD8⁺ T细胞在免疫检查点标志物表达上存在差异
第3周，低滴度和高滴度携带者C93特异性CD8⁺ T细胞上PD-1、LAG-3和TOX表达水平或表达PD-1及共表达PD-1/LAG-3或TOX的细胞频率无显著差异。第5周MVA加强后，高滴度携带者C93特异性CD8⁺ T细胞上PD-1、LAG-3和TOX表达显著升高，与细胞因子产生丧失时间上相关。高滴度携带者中表达一个或多个这些分子的C93特异性CD8⁺ T细胞比例持续显著升高，而低滴度小鼠中这些频率逐渐降低。共刺激分子4-1BB在高滴度携带者完成完整疫苗接种方案后也在C93特异性CD8⁺ T细胞上显著上调，动力学与共抑制标志物相似，且大多数4-1BB⁺ C93⁺ CD8⁺ T细胞共表达PD-1。

四、讨论与结论

本研究首次证明，临床候选治疗性疫苗TherVacB在高HBV载量存在的情况下诱导HBV特异性CD8⁺ T细胞的效率与低水平持续性感染相当。然而，高滴度HBV携带者中疫苗诱导的CD8⁺ T细胞尽管最初展现一定抗病毒效力，但被困于肝脏，逐渐功能失调并最终被清除。CD8 T细胞效应功能丧失与检查点抑制剂（如PD-1）、耗竭相关转录因子TOX和共刺激分子4-1BB的过表达相关。研究发现，核心特异性CD8⁺ T细胞在清除持续性HBV感染中发挥关键作用。MVA加强是决定治疗性疫苗接种结局的关键时刻：低滴度携带者中MVA加强导致肝内核心特异性效应CD8⁺ T细胞快速扩增并与持续性HBV感染清除相关；高滴度携带者中这些细胞虽上调Cxcr6但未能控制感染并完全丧失效应功能。研究还发现高滴度小鼠中即使存在与低滴度小鼠相当数量和中和能力的anti-HBs抗体，循环HBsAg水平仍反弹，强调疫苗诱导的细胞毒性CD8⁺ T细胞在减少肝脏HBsAg储备和维持功能性HBV治愈中的作用。

高滴度携带者中Cxcr6在核心特异性CD8⁺ T细胞上的强烈上调可能作为活化CD8⁺ T细胞的"陷阱"，阻止其归巢至脾脏，最终在肝脏中逐渐消亡。几乎所有的TherVacB诱导的CD8⁺ T细胞不仅持续上调PD-1，还共表达高水平TOX，TOX通过表观遗传改变维持病毒特异性CD8⁺ T细胞的耗竭状态，意味着一旦疫苗诱导的CD8⁺ T细胞表达TOX，即使进一步治疗也可能无法恢复功能。4-1BB在高滴度携带者肝脏疫苗诱导CD8⁺ T细胞上的显著升高与细胞因子产生丧失在时间上密切相关，提示4-1BB可能涉及肝脏免疫 rheostat 机制，靶向4-1BB可能是增强高滴度HBV感染中治疗性疫苗疗效的有前景方法。

结论：本研究阐明了高HBV抗原载量如何在治疗性疫苗接种后抑制抗病毒CD8 T细胞免疫，为设计针对慢性乙型肝炎的更有效免疫治疗策略提供了宝贵见解。研究确定了一个关键时间窗口，在此期间早期干预以预防或逆转T细胞功能障碍可能是决定性的，支持将治疗性疫苗接种与早期应用的抗原降低或免疫调节策略相结合以实现慢性HBV感染的持久免疫控制。该研究发表在《JHEP Reports》。