《RSC Chemical Biology》：PrismaLuc luciferase enables tunable near-infrared bioluminescence for in vivo imagingOpen Access
编辑推荐：
生物发光成像（Bioluminescence imaging, BLI）能够对活体动物中的生物学过程进行无创监测，然而大多数生物发光报告基因以固定波长发射，光谱灵活性有限，制约了其在多重检测和深组织应用中的使用。生物发光共振能量转移（Bioluminescen
生物发光成像（Bioluminescence imaging, BLI）能够对活体动物中的生物学过程进行无创监测，然而大多数生物发光报告基因以固定波长发射，光谱灵活性有限，制约了其在多重检测和深组织应用中的使用。生物发光共振能量转移（Bioluminescence resonance energy transfer, BRET）通过将荧光素酶与邻近的荧光蛋白或合成荧光团偶联，吸收其发射光并以更长波长重新发射，为此提供了解决方案。然而，现有的基于荧光素酶-荧光蛋白融合构建的BRET系统受限于次优的能量转移效率以及基因编码生色团固定的光物理性质。研究人员近期引入了PrismaLuc，一种高效率BRET报告基因，其中环化置换的NanoLuc被插入HaloTag中，能够向共价结合的合成荧光团实现高效能量转移，其发射波长通过配体选择来确定。在最初的研究报告中，PrismaLuc与JF549 HaloTag配体配对用于双色细胞水平检测。在此，研究人员将PrismaLuc扩展至使用远红和近红外HaloTag配体的活体生物发光成像。在培养细胞中，使用JF608和JF669 HaloTag配体标记分别产生640 nm和690 nm的发射峰。与已建立的BRET报告基因直接比较显示，在高于665 nm的波长下（该波段在组织中衰减较小），PrismaLuc具有更高的光子输出。在荷瘤小鼠中，PrismaLuc:JF669产生约700 nm的发射峰，活体荧光成像证实JF669 HaloTag配体具有足够的生物利用度以标记异种移植肿瘤中表达的PrismaLuc。最后，在共植入表达NanoLuc和PrismaLuc细胞的小鼠中进行的双色成像显示出清晰的谱学分离，实现了同一动物内的多重检测。综上所述，这些结果确立了PrismaLuc作为活体近红外和双色生物发光成像的可调谐平台。
一、研究背景与问题
生物发光成像（Bioluminescence imaging, BLI）凭借高灵敏度、低背景以及无需外部激发光等优势，被广泛应用于体外和活体内的生物学过程监测。然而，活体应用对报告基因提出了更高要求：以NanoLuc为代表的明亮荧光素酶与氟呋喃嗪（fluorofurimazine, FFz）底物配对后，其发射波长固定于蓝-黄光范围（约460 nm），该波段在组织中受到强烈的吸收和散射衰减，严重限制了深部组织的检测灵敏度，也增加了活体多重成像的难度。因此，开发兼具高亮度与可调谐、红移发射特性的报告基因成为该领域的关键需求。
生物发光共振能量转移（Bioluminescence resonance energy transfer, BRET）通过将荧光素酶供体与邻近的荧光受体偶联，将能量转移至受体并以更长波长重新发射，从而实现发射光谱的红移。早期基于海肾荧光素酶（Renilla luciferase, RLuc）的BRET系统虽已实现活体近红外成像，但受限于光子输出较低、生色团成熟依赖胆绿素以及受体发射光谱固定等缺陷。NanoLuc因其体积小、亮度高、发射谱窄等优势，已成为活体BRET应用的首选供体。然而，现有的NanoLuc基BRET报告基因（如Antares和红色NanoLanterns）均依赖基因编码的荧光蛋白作为受体，其发射光谱和光物理性质在设计构建时即已固定，无法灵活调节。
HaloTag自标记蛋白能够共价结合氯烷烃连接的荧光团，允许使用多种合成染料进行可互换标记。Janelia Fluor（JF）染料家族中覆盖红至近红外光谱范围的HaloTag配体，可将发射延伸至荧光蛋白受体难以支持的波段，并已在活体小鼠组织中验证了高效的标记能力。基于此，研究人员此前开发了PrismaLuc——一种将环化置换NanoLuc插入HaloTag的高效率BRET报告基因，实现了88.9%的表观BRET效率。本研究旨在将PrismaLuc的应用扩展至活体近红外生物发光成像，验证其与远红及近红外JF HaloTag配体配对后的成像性能。
二、研究内容与结论
研究人员系统评估了PrismaLuc与JF552、JF608和JF669三种HaloTag配体配对后的光谱调谐能力，在细菌和多种哺乳动物细胞系中均观察到配体依赖性的红移发射，发射峰分别约为580 nm、640 nm和690 nm。在HCT116细胞中，研究人员将PrismaLuc与已建立的BRET报告基因Antares和NanoLanterns进行了直接比较，结果显示PrismaLuc:JF669在665 nm以上波段的积分光子输出分别是Antares的4.7倍、NanoLantern ReNL的8.6倍和NanoLantern mCRedNL-tdT的26倍。活体实验中，研究人员通过腹腔（IP）或静脉（IV）注射给予荷瘤小鼠2.5 nmol JF669 HaloTag配体，荧光成像证实了配体的全身分布和肿瘤生物利用度，且2.5 nmol剂量即可产生可检测的BRET信号。在活体生物发光成像中，PrismaLuc:JF669在肿瘤部位产生约700 nm的发射峰，相比未修饰NanoLuc红移约240 nm。双色成像实验中，研究人员将表达NanoLuc和PrismaLuc的细胞分别植入小鼠两侧 flank，经JF669配体处理后，PrismaLuc位点选择性产生近红外发射，与NanoLuc的蓝色发射形成超过240 nm的光谱分离，实现了同一动物内的多重检测。该研究发表于《RSC Chemical Biology》。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下核心技术方法：1）基于BRET的报告基因设计，将环化置换NanoLuc插入HaloTag形成PrismaLuc融合蛋白；2）使用Janelia Fluor（JF）系列HaloTag合成配体（JF552、JF608、JF669）实现共价标记和光谱调谐；3）慢病毒转导结合荧光激活细胞分选（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）建立稳定表达细胞系；4）mRNA体外转录及转染用于报告基因的等摩尔比较；5）IVIS Spectrum成像系统进行活体荧光和生物发光成像及光谱采集；6）Living Image软件进行光谱解混分析。动物实验使用BALB/c裸鼠（6–8周龄，购自Charles River Laboratory），皮下接种HCT116或HEK293T细胞建立肿瘤模型。
四、研究结果
1. PrismaLuc光谱调谐的系统特异性验证
研究人员将PrismaLuc克隆至细菌表达载体并在大肠杆菌（E. coli）中表达，同时通过慢病毒转导和FACS分选建立了稳定的HEK293T和HCT116细胞系。经JF552、JF608或JF669配体标记并添加Nano-Glo底物后，PrismaLuc在细菌和哺乳动物细胞中均产生明亮的生物发光信号，发射峰分别约为580 nm、640 nm和690 nm，而生物素对照组呈现蓝色发射。结果表明PrismaLuc能够通过单一遗传构建实现配体依赖性的发射波长调节。
2. PrismaLuc相比已建立BRET报告基因具有增强的近红外输出
研究人员通过mRNA转染在HCT116细胞中以等摩尔量表达PrismaLuc、Antares和NanoLanterns（ReNL和mCRedNL-tdT），使用FFz底物进行光谱分析。PrismaLuc:JF669在665 nm以上波段的积分光子输出最高，分别是PrismaLuc:JF608的1.3倍、Antares的4.7倍、ReNL的8.6倍和mCRedNL-tdT的26倍。使用GloMax Galaxy成像系统配备460/50 nm带通、600 nm长通和665 nm长通滤光片成像，PrismaLuc:JF669在665 nm长通滤光片下信号最强，而NanoLantern变体在该波段不可检测。逐像素比值成像（665 LP/460 BP）进一步确认PrismaLuc:JF669具有最高的受体-供体比值。
3. HaloTag配体的全身给药实现活体生物利用度
研究人员对荷HCT116肿瘤的BALB/c裸鼠通过IP或IV途径给予2.5、5或10 nmol JF669 HaloTag配体。荧光成像显示2.5 nmol剂量即可产生可检测的PrismaLuc BRET信号，证实了配体的全身分布和肿瘤生物利用度。荧光强度在注射后24和96小时显著下降10至20倍，表明配体被逐步清除。
4. PrismaLuc实现活体近红外生物发光成像
荷HCT116 PrismaLuc肿瘤小鼠经JF669配体和FFz底物给药后，在肿瘤部位检测到红移发射，活体发射峰约为700 nm，与培养细胞中观察到的690 nm峰一致，相对未修饰NanoLuc红移约240 nm。在最早测量时间点，IV给药后58%和IP给药后48.4%的光谱分辨肿瘤信号位于近红外范围（660–760 nm）。远红贡献在24小时下降至约15%，第4天降至约2%。信号衰减反映了已标记PrismaLuc的周转以及配体清除后无法标记新合成的报告基因。
5. PrismaLuc支持单底物双色活体生物发光成像
研究人员将表达NanoLuc（左 flank）和PrismaLuc（右 flank）的HEK293T细胞皮下植入BALB/c裸鼠。经10 nmol JF669配体预处理的实验组中，近红外发射选择性出现在PrismaLuc位点，而NanoLuc位点保持蓝色发射，产生超过240 nm的光谱分离。通过Living Image软件的库引导光谱解混功能，实现了同一动物内两种信号的清晰分离。对照组（盐水处理）中两侧均呈现蓝色发射。
五、讨论与结论
PrismaLuc通过将NanoLuc的亮度与HaloTag配体的灵活性相结合，建立了可调谐生物发光成像的模块化策略。通过可互换的合成荧光团，PrismaLuc无需修改底层遗传构建即可实现从可见光到近红外光谱范围内的发射调谐，为根据组织深度、光谱分离或仪器配置调整报告基因发射提供了实用途径。相比此前使用RLuc–iRFP嵌合体实现的近红外BRET，PrismaLuc以更亮的供体实现了相当的发射波长，并具有配体选择带来的光谱可调谐优势。该策略的一个权衡是需要额外的HaloTag配体给药步骤，且最佳红移发射依赖于足够的报告基因占据率。由于HaloTag标记是共价的，已标记的报告分子在配体结合后保持标记状态，因此最佳性能主要取决于配体的生物利用度、剂量和给药时机。该研究在皮下、空间分离的肿瘤模型中建立了概念验证。PrismaLuc的细菌表达兼容性提示其在追踪工程微生物、益生菌定殖或细菌体内分布方面的潜在应用；在哺乳动物系统中，利用单一底物实现NanoLuc和PrismaLuc信号的光谱分离，可支持空间或解剖学上分离的细胞群体的同步监测，或细胞治疗与疾病负担的多重评估。未来研究需确定最佳给药剂量和成像时间点，并评估在更深或重叠生物学场景中的光谱分辨能力。
