空间转录组学揭示慢加急性肝衰竭中受损的代谢性肝脏分区

《JHEP Reports》：Spatial transcriptomics reveal impaired metabolic liver zonation in acute-on-chronic liver failure

　　

背景与目的：肝外器官衰竭是慢加急性肝衰竭(ACLF)短期预后的关键决定因素。尽管全身炎症和线粒体功能障碍在ACLF发病中的作用已被熟知，但肝脏本身的贡献仍不清楚。研究人员因此对ACLF患者肝脏进行转录组与功能分析，以识别肝源性驱动因素。 方法：研究人员对代偿期肝硬化、失代偿期肝硬化或ACLF患者的肝脏标本进行批量RNA测序(bulk RNA sequencing)与空间转录组学(spatial transcriptomics)分析，并进一步分析能量代谢相关基因、代谢组学及功能实验。 结果：共纳入39例患者（9例代偿期肝硬化、15例失代偿期肝硬化、15例ACLF）。ACLF的肝脏转录组变化明显不同于代偿期和失代偿期肝硬化。ACLF中下调最显著的是底物代谢与线粒体功能相关通路，包括葡萄糖与氨基酸代谢多个基因下调。空间转录组学显示ACLF中功能性肝脏分区崩溃，专司糖异生/β-氧化的肝细胞比例下降（代偿期肝硬化68%、失代偿期肝硬化52%、ACLF 12%；P<0.03）。支链酮酸脱氢酶激酶(BCKDK)这一支链氨基酸分解代谢关键调控因子在ACLF中显著下调（相对代偿期肝硬化0.33倍表达，P<0.05），并可能将支链氨基酸与葡萄糖代谢失调联系起来。 结论：ACLF以肝脏转录组的特异性改变为特征，影响底物代谢与线粒体功能关键通路，并伴随功能性肝脏分区丧失。BCKDK下调值得关注，因其可将支链氨基酸代谢改变与糖生成受损相联结。 影响与意义：肝外器官衰竭虽是ACLF典型表现，但肝脏本身在其中的作用机制不明。通过肝脏标本的RNA测序与空间转录组学，研究人员发现严重的肝脏代谢与线粒体程序受损，提示肝脏可能通过损害机体能量供应，在肝外器官衰竭发生中发挥关键作用，这为以肝脏分子靶点为ACLF治疗策略提供依据。

《JHEP Reports》论文解读：慢加急性肝衰竭中代谢性肝脏分区受损的空间转录组学研究

研究背景方面，慢加急性肝衰竭(ACLF)被欧洲肝病学会-慢性肝衰竭(EASL-CLIF)联盟定义为肝硬化急性失代偿合并明确器官衰竭且短期死亡风险高的临床综合征。现有证据多来自血液炎症介质、细胞死亡标志物、免疫细胞和外周免疫细胞线粒体功能研究，肝脏本身从代偿期、失代偿期到ACLF的分子水平变化数据很少。全身炎症、细胞死亡和线粒体功能障碍虽被视为ACLF定义性器官衰竭的关键机制，但肝脏作为机体底物与能量代谢中枢的具体贡献并不清楚。因此，研究人员开展本研究，以明确ACLF肝脏内转录组、空间代谢分区及支链酮酸脱氢酶激酶(BCKDK, branched-chain ketoacid dehydrogenase kinase)相关代谢重编程的作用。

研究人员对2021年10月至2024年12月在慕尼黑LMU大学医院接受肝移植的肝硬化患者进行分析，排除近6个月饮酒、妊娠哺乳、超米兰标准肝细胞癌和HIV阳性者，按EASL-CLIF标准分为代偿期肝硬化、失代偿期肝硬化和ACLF，最终纳入39例；空间转录组学亚组为每组3例高质量标本。研究得出核心结论：ACLF具有区别于代偿期和失代偿期肝硬化的肝脏转录组特征，底物代谢与线粒体功能广泛下调，功能性肝脏分区崩溃，BCKDK下调可能将支链氨基酸代谢与糖代谢障碍联系起来，肝脏代谢衰竭可参与肝外器官衰竭发生。该研究的重要意义在于把ACLF研究重心从“肝外炎症”回扣到“肝脏本身代谢失效”，为肝内分子靶点治疗提供理论依据。

关键技术方法上，研究人员采用肝移植切除标本，使用Lexogen QuantSeq 3′ mRNA测序的批量RNA测序(bulk RNA sequencing)做全转录组与基因集富集分析；以Xenium In Situ(10X Genomics)对9例标本做空间转录组学，用stLearn和Scanpy进行细胞注释与分区分析；以定量PCR和Western Blot验证BCKDK与磷酸化BCKDH(p-BCKDH)；在VIB代谢组学中心做非靶向与靶向代谢组学；用原代人肝细胞经BCKDK抑制剂BT2处理进行糖生成功能实验。

研究结果如下。

患者特征：研究人员纳入39例并列表描述基线、实验室与器官衰竭情况，显示ACLF组CLIF-OF、MELD、肌酐、胆红素、感染比例均高于其余两组，为后续分组比较提供队列基础。

ACLF is associated with impaired expression of genes involved in energy metabolism and mitochondrial function：批量RNA测序显示ACLF转录组独立成簇，差异基因集中于底物代谢、线粒体功能与自噬，BCKDK、ADCY4、DPP4、ADH4、DENND3变化最显著，定量PCR验证BCKDK在ACLF分别为代偿期和失代偿期的0.33倍与0.5倍。

Spatial resolution of expression of key genes involved in metabolism：空间转录组学显示BCKDK与DPP4在糖代谢肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞及部分免疫细胞表达，ADH4主要限于肝细胞，ADCY4主要限于肝窦内皮细胞(LSECs)，DENND3在库普弗细胞和LSECs强表达，印证批量结果具有空间异质性。

ACLF is characterized by changes in the functional zonation of the liver：利用已发表标志物，研究人员发现ACLF中糖异生/β-氧化肝细胞比例由代偿期68%降至12%，免疫激活表型肝细胞增加，说明功能性肝脏分区丧失。

ACLF is associated with dysregulation of multiple genes involved in glucose, fructose and fatty acid metabolism：定向分析显示糖酵解、糖异生、果糖分解及脂肪酸生物合成与β-氧化相关基因如PGM1、PKLR、KHK、ACSL5、HSD17B8在ACLF下调。

BCKDK expression is associated with impaired glucose metabolism：研究人员发现ACLF中p-BCKDH降低，BCKDK表达与糖代谢基因、血清丙酮酸正相关而与血糖负相关；靶向代谢组学显示其与糖酵解中间体相关；BT2抑制BCKDK后原代肝细胞糖生成下降，支持BCKDK下调导致肝糖输出受损。

讨论部分总结：研究人员指出，EASL-CLIF定义虽具预后价值，但本研究显示ACLF肝脏本身存在强烈转录组重编程。底物代谢、氨基酸代谢和线粒体功能下调以及空间分区崩溃，使肝脏无法维持全身葡萄糖与其他底物供应，从而助推肝外器官衰竭。BCKDK下调可同时联结支链氨基酸分解增强、糖异生受抑、糖酵解偏移、丙酮酸脱氢酶复合体受抑和线粒体基因抑制。研究局限包括样本量小、代偿期标本少、所有组织来自肝移植可能存在缺血影响、不能区分BCKDK下调为因或果。

结论部分翻译：ACLF以肝脏转录组的特异性改变为特征，这些改变影响底物代谢与线粒体功能中的关键通路，并与功能性肝脏分区丧失相关。ACLF中BCKDK下调尤其值得关注，因其可将支链氨基酸代谢改变与糖生成受损相联结。上述变化可能参与ACLF定义性器官衰竭的发病机制。