《RSC Advances》：Integrated molecular networking-guided discovery of antimicrobial secondary metabolites from Thyronectria pinicolaOpen Access
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采用基于LC-MS/MS的分子网络引导策略，从Thyronectria pinicola（子囊菌门：肉座菌目）的谷物培养物中分离得到3个前所未有的氯化间苯二酸内酯衍生物（5–7）、2个新的克莱斯坦烷型二萜类化合物（11–12）、1个新的二聚体衍生物（13），以
采用基于LC-MS/MS的分子网络引导策略，从Thyronectria pinicola（子囊菌门：肉座菌目）的谷物培养物中分离得到3个前所未有的氯化间苯二酸内酯衍生物（5–7）、2个新的克莱斯坦烷型二萜类化合物（11–12）、1个新的二聚体衍生物（13），以及7个已知代谢物。T. pinicola分离自“魔鬼牙齿”蘑菇Hydnellum peckii（担子菌门：革菌目）的子实体。通过一维和二维核磁共振波谱（NMR）及高分辨质谱（HRMS）阐明所得化合物的结构，并通过电子圆二色谱（ECD）计算或X射线晶体学确定其绝对构型。研究人员评估了所有代谢物对三种主要人类真菌病原体——烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、白色念珠菌（Candida albicans）和新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的生物活性。结果表明，化合物1为活性最强物质，对三种菌的最小抑菌浓度（MIC）值范围为1.5至50 μg mL?1。相比之下，化合物5和10仅对烟曲霉和新型隐球菌表现出中等活性。
**论文解读：基于分子网络引导的Thyronectria pinicola抗微生物次级代谢产物发现**
**1. 研究背景与问题**
抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）已成为全球重大公共卫生挑战，预测若不采取有效措施，到2050年每年可导致高达1000万人死亡。AMR的影响涉及社会经济、临床和公共卫生等多个层面，增加治疗成本并阻碍可持续发展目标（SDGs）的实现。在欧盟和欧洲经济区（EEA），AMR年成本估计约为117亿欧元，其中66亿为额外医疗保健支出，51亿为劳动力参与减少导致的经济损失。为应对AMR挑战，发现新型抗菌药物仍是最有效途径之一。微生物天然产物历史上为提供多样有效的抗菌先导化合物发挥了关键作用，截至2025年发现的217种天然产物衍生抗生素（天然及半合成衍生物）大多来自放线菌和真菌等微生物。在各类微生物来源中，共生微生物如植物和蘑菇内共生真菌虽具有显著生物合成潜力，但仍研究不足。子囊菌门（Ascomycota）是真菌界最大的谱系，现有超过80000种，但全球真菌多样性仍被严重低估，仅约16万种真菌被正式接受，而总多样性预计约300万种，表明大量子囊菌多样性尚未开发。近年来非靶向代谢组学方法，包括基于GNPS的分子网络和SIRIUS等计算机注释工具，为系统探索这一隐藏代谢组提供了有力手段。T. pinicola属于丛赤壳科（Nectriaceae）肉座菌目（Hypocreales），此前报道可导致松树溃疡病和枯萎病，但尚无关于该属物种的生物勘探研究。研究人员从蘑菇H. peckii子实体中分离到该真菌，初步评价其乙酸乙酯提取物对白色念珠菌和新型隐球菌表现出潜在拮抗作用，MIC值为100 μg mL
?1。因此，本研究旨在通过非靶向代谢组学分析，揭示T. pinicola产生的抗微生物成分及其化学多样性，并定向分离新的次级代谢产物。
**2. 主要技术方法**
研究人员采用LC-MS/MS非靶向代谢组学方法分析真菌提取物亚级分，使用Mzmine 4.6.1处理质谱数据，生成特征化分子网络（FBMN）并提交至GNPS2平台进行网络分析，同时利用SIRIUS进行化合物类别注释和去重复化。通过系统溶剂分级、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱及半制备高效液相色谱（HPLC）对目标化合物进行定向分离。化合物结构通过一维/二维核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HRMS）、电子圆二色谱（ECD）计算及单晶X射线衍射（X-ray crystallography）确定。真菌菌株分离自奥地利蒂罗尔州Ellb?gen（海拔1070米）的混合林中采集的H. peckii子实体，基于rDNA ITS序列进行系统发育鉴定。抗真菌活性采用肉汤微量稀释法测定MIC值。
**3. 研究结果**
**3.1 系统发育分析**
基于rDNA ITS序列的最大似然法和贝叶斯分析表明，分离菌株与已知Thyronectria pinicola序列以99–100%的相似性聚为一支，确认为T. pinicola。这是首次从真菌担子果中分离到该种，推测其定殖可能通过外生菌根根尖发生。
**3.2 非靶向代谢组学分析与化合物结构鉴定**
通过LC-MS/MS分析和FBMN，研究人员鉴定出提取物主要包含聚酮类（如大环内酯类）、萜类和肽类三大类化合物。活性评价显示F10–F17和F24级分对白色念珠菌和新型隐球菌抑制活性最强，其中主要代谢物被GNPS注释为radicicol（1），一种已知热休克蛋白90（HSP90）抑制剂。FBMN分析揭示了多个大环内酯簇和萜类簇，通过定向分离获得13个化合物：已知RAL衍生物1–4（radicicol, monorden D, pochonin G, pocholin L），新化合物piniconol A（5）、B（6）、C（7），以及6个克莱斯坦烷型二萜（8–13），其中11、12为新化合物，13为新二聚体衍生物。通过NMR、HRMS、ECD计算（5–7、11、12）和X射线晶体学（1和13）确定了所有化合物的结构和绝对构型。
**3.3 抗真菌活性评价**
所有化合物对三种人类真菌病原体（烟曲霉、白色念珠菌、新型隐球菌）进行活性测试。结果显示，化合物1（radicicol）活性最强，MIC值分别为烟曲霉50 μg mL
?1、白色念珠菌6.25 μg mL
?1、新型隐球菌1.56 μg mL
?1。化合物5对新型隐球菌MIC为50 μg mL
?1，化合物11对烟曲霉MIC为50 μg mL
?1，均表现中等活性，其余化合物在测试浓度内无显著活性。
**4. 讨论与结论**
化合物1的活性可归因于其高丰度和强生物活性。此前构效关系研究表明，RAL类化合物中C-4–C-5环氧部分和C-8–C-10不饱和酮结构是重要活性基团，这解释了衍生物2–7活性降低或缺失的原因。T. pinicola中RALs和克莱斯坦烷型二萜的共存表明该属具有多样化的生物合成能力，进一步支持肉座菌目产生结构多样聚酮类化合物的代谢潜力。克莱斯坦烷型二萜虽主要报道于高等植物，但多个真菌属也能产生此类化合物，本研究扩展了丛赤壳科二萜骨架的化学多样性。总之，该研究证明了整合LC-MS/MS代谢组学、FBMN和SIRIUS引导注释在高效优先分离未充分开发真菌类群次级代谢产物方面的实用性，并支持蘑菇相关真菌作为结构独特生物活性代谢物的潜在来源。研究结论：T. pinicola的谷物培养物中含有丰富多样的RAL衍生物和克莱斯坦烷型二萜，其中radicicol为主要抗真菌活性成分；共存的RALs和克莱斯坦烷型二萜表明该属具有多样的生物合成能力，并进一步强调其作为化学独特真菌次级代谢产物来源的潜力；蘑菇相关真菌是尚未充分开发的结构独特生物活性代谢物储库。
