新型N-(4-(chlorodifluoromethoxy)phenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-5-carboxamide衍生物的设计、合成、分子对接及抗癌活性

《RSC Advances》：Design, synthesis, molecular docking and anticancer activity of novel N-(4-(chlorodifluoromethoxy)phenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-5-carboxamide derivativesOpen Access

　　

新型N-(4-(chlorodifluoromethoxy)phenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-5-carboxamide衍生物被设计、合成并评估为潜在抗癌剂。在合成的衍生物中，化合物9c对BCR-ABL1阳性的K562白血病细胞表现出最高的效力，IC₅₀为0.26 ± 0.029 μM，其次是9a（0.50 ± 0.005 μM）、9k（0.64 ± 0.075 μM）和9l（0.69 ± 0.11 μM）。重要的是，化合物9a、9c和9k对白血病细胞具有选择性，且对正常成纤维细胞毒性较低（IC₅₀ > 50 μM），选择性指数为100–192。对接分析表明，所设计的类似物保留了Asciminib的关键药效团相互作用，其中化合物9k显示出最佳的对接分数（?42.07 kcal mol^?1），其次是9a（?40.44 kcal mol^?1），而Asciminib为?40.13 kcal mol^?1。综上，这些结果表明，N-(4-(chlorodifluoromethoxy)phenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-5-carboxamide骨架是设计选择性BCR-ABL1导向抗癌剂的有用模板，其中化合物9c是进一步优化和机制研究的有前景的先导化合物。

慢性髓系白血病（CML）是一种由BCR-ABL1融合酪氨酸激酶驱动的克隆性骨髓增殖性疾病。BCR-ABL1融合蛋白具有组成型酪氨酸激酶活性，可激活PI3K/AKT、RAS/MAPK和JAK/STAT等下游信号通路，导致造血干细胞失控增殖。第一代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）伊马替尼虽显著改善了CML患者的生存，但长期使用导致的获得性耐药（如激酶域点突变）以及第二代/第三代抑制剂（达沙替尼、尼洛替尼、博舒替尼、普纳替尼）的毒副作用（如心血管事件、骨髓抑制、胸腔积液等）仍是临床上的重大挑战。因此，开发结构新颖、选择性高且能规避现有耐药机制的BCR-ABL1抑制剂具有重要意义。本研究以已上市的别构BCR-ABL1抑制剂Asciminib为模板，设计并合成了一系列新型N-(4-(chlorodifluoromethoxy)phenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-5-carboxamide衍生物，旨在通过保留关键药效团并系统优化C3位取代基，获得具有高选择性和低毒性的抗白血病候选化合物。该研究成果发表于《RSC Advances》。

研究人员设计并合成了16个目标化合物（9a–9p），通过核磁共振、高分辨质谱和高效液相色谱确认了结构；采用分子对接和分子动力学模拟分析了化合物与BCR-ABL1别构口袋的结合模式；并使用MTST还原实验评估了化合物对多种癌细胞和正常成纤维细胞的细胞毒性。主要关键技术方法包括：钯催化羰基化、NIS碘代、SEM保护、HATU介导的酰胺偶联、Suzuki–Miyaura偶联及TFA脱保护等化学合成手段；细胞毒性实验所用细胞系均购自ATCC（Middlesex, UK）和DSMZ（Braunschweig, Germany），包括K562、A549、CCRF-CEM、HCT116、HCT116 p53^?/?、U2OS以及人正常成纤维细胞BJ和MRC-5；分子对接使用ICM-Pro 3.9-5a程序（Molsoft），分子动力学模拟使用OpenMM 8包和CHARMM36力场。

研究结果如下：

**Rational design**：基于Asciminib与BCR-ABL1肌豆蔻酰口袋的结合模式，研究人员将Asciminib的吡啶/羟吡咯烷/吡唑药效团融合到pyrrolo[2,3-b]pyridine双环骨架中，保留4-(chlorodifluoromethoxy)苯基和酰胺连接基团，并在C3位引入不同杂环（如吡唑、嘧啶、吡啶、喹啉等）以考察取代基对活性的影响。

**Chemistry**：以5-溴-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine为起始原料，经Pd(dppf)Cl₂·DCM催化羰基化得到甲酯2，经NIS碘代得3，SEM保护后水解得到羧酸5，与4-(chlorodifluoromethoxy)苯胺经HATU缩合得到关键中间体7，再经Suzuki–Miyaura偶联和TFA脱SEM保护得到目标化合物9a–p，总产率合理，结构经光谱数据确证。

**Biology**：化合物9a–9p的细胞毒性实验表明，9c对BCR-ABL1阳性K562白血病细胞活性最强（IC₅₀ = 0.26 ± 0.029 μM），其次为9a（0.50 ± 0.005 μM）、9k（0.64 ± 0.075 μM）和9l（0.69 ± 0.11 μM）。9a、9c和9k对正常成纤维细胞（BJ、MRC-5）的IC₅₀均大于50 μM，选择性指数（SI）分别为100、192和78.1，表明其优先杀伤白血病细胞。9l在CCRF-CEM、HCT116等实体瘤细胞中表现出较广谱的活性，但其对正常细胞的选择性低于9c。多数化合物在A549、HCT116、U2OS等实体瘤细胞中显示中等活性，而9b和9k对A549基本无活性，提示其更倾向作用于血液系统恶性肿瘤。

**Molecular docking**：分子对接验证实验中，Asciminib的再对接构象与晶体结构叠合良好（RMSD = 0.93 ?）。对接结果显示，所有活性化合物均保留了Asciminib在别构口袋中的关键药效团相互作用，其中9k的对接分数最优（?42.07 kcal mol^?1），优于Asciminib（?40.13 kcal mol^?1）和9a（?40.44 kcal mol^?1）。极性杂环（如吡唑、嘧啶、吡啶）可与Glu481形成氢键，而含甲基、甲氧基、二甲基等疏水取代的化合物（如9d、9j、9p）对接分数显著降低，表明C3位极性基团对维持结合至关重要。分子动力学模拟显示，活性化合物9c与蛋白复合物在100 ns模拟中保持稳定，蛋白-配体接触数（约14–21）明显高于无活性化合物9p（约12–14），且9c可诱导蛋白质向稳定构象转变，而9p则持续波动，这从动态层面解释了9c的高活性。

讨论部分指出，虽然合成化合物的活性低于临床优化的Asciminib（K562 IC₅₀ = 0.010 ± 0.001 μM），但9c、9a和9k具有亚微摩尔级活性和远高于以往ATP竞争性抑制剂的选择性（SI > 78），提示氯二氟甲氧基可能增强对恶性细胞与正常细胞的区分能力。化合物9c可作为进一步结构优化和机制研究的先导化合物。

研究结论可翻译为：总之，所合成的N-(4-(chlorodifluoromethoxy)phenyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-5-carboxamide衍生物在所测癌细胞系中表现出良好的抗癌活性，尤其对K562白血病细胞作用显著。在所测衍生物中，9c对K562细胞活性最强，IC₅₀为0.26 ± 0.03 μM，且选择性指数高（SI = 192），其次是9a（IC₅₀ = 0.50 ± 0.01 μM；SI = 100）和9k（IC₅₀ = 0.64 ± 0.08 μM；SI = 78.1）。尽管这些化合物的活性不如Asciminib（K562 IC₅₀ = 0.010 ± 0.001 μM），但其良好的亚微摩尔活性和初步选择性支持其作为进一步优化先导结构的潜力。分子对接及进一步的分子动力学研究为其与靶点的可能相互作用提供了见解。总体而言，9c、9a和9k是进一步结构优化的先导化合物，而靶点特异性、机制和体内研究仍需开展，以确定其分子作用模式和治疗潜力。