黄酮类化合物和查尔酮作为选择性α-葡萄糖苷酶抑制剂：从酶学筛选到利用人源酶进行验证

《RSC Medicinal Chemistry》：Flavonoids and chalcones as selective α-glucosidase inhibitors: from enzymatic screening to validation using the human enzymeOpen Access

　　

α-葡萄糖苷酶是餐后血糖控制的关键治疗靶点，但大多数临床可用的抑制剂同时也抑制α-淀粉酶，导致胃肠道不良反应。天然多酚类化合物已被广泛报道为强效且选择性的α-葡萄糖苷酶抑制剂，这些报道主要基于使用酵母来源酶和合成底物的筛选实验。在本研究中，研究人员首先采用这种常规方法评估了十三种黄酮类化合物和五种查尔酮，以阐明选择性α-葡萄糖苷酶抑制的结构决定因素。其中，金雀异黄酮（genistein）和杨梅素（myricetin）被确定为酵母α-葡萄糖苷酶最有效的抑制剂，其半数抑制浓度（IC50）值显著低于目前应用最广泛的α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖（acarbose）。这两种黄酮类化合物均表现出高选择性，对α-淀粉酶几乎无抑制或仅有极微弱的抑制作用。为评估这些发现的转化相关性，研究人员随后使用生理性底物麦芽糖（maltose），在C2BBe1细胞提取物来源的人源α-葡萄糖苷酶上对这些化合物进行了测试。在这些条件下，仅杨梅素在低浓度下保留了可测量的抑制活性，并通过色谱分析进一步验证。这些发现表明，当前仅依赖酵母α-葡萄糖苷酶的筛选策略可能显著高估天然多酚类化合物的抑制活性。本研究强调了在新型α-葡萄糖苷酶抑制剂发现过程中纳入生理相关酶源、天然底物以及分光光度法测定干扰对照的重要性，为天然产物的评估提供了更可靠的工作流程。

论文解读

一、研究背景与研究目的

糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是全球十大死亡原因之一，据国际糖尿病联盟估计，2024年全球20至79岁成年人中有约5.89亿人患有糖尿病，预计到2050年这一数字将增长46%达到8.53亿。糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性内分泌疾病，持续高血糖可导致多种急慢性并发症，因此维持最佳血糖水平是糖尿病患者的主要治疗目标。

在2型糖尿病中，血糖水平可通过调节膳食葡萄糖来源（如淀粉）消化所涉及的酶促途径来控制。在淀粉水解的早期阶段，多糖通过α-淀粉酶切割内部α-d-(1→4)糖苷键被分解为较短的寡糖和二糖（如麦芽糖）。随后，α-葡萄糖苷酶（麦芽糖酶-葡糖淀粉酶（maltase-glucoamylase, MGAM）和蔗糖酶-异麦芽糖酶（sucrase-isomaltase, SI））水解α-淀粉酶产物的非还原端。人肠道α-葡萄糖苷酶的四个催化亚基均具有较高的α-1,4-外切葡糖苷酶活性，但各自具有不同的底物特异性。

抑制α-葡萄糖苷酶可延缓淀粉消化和随后的葡萄糖吸收，从而有助于调节餐后血糖反应。尽管已有临床获批的α-葡萄糖苷酶抑制剂（阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇），但它们的主要局限性在于缺乏选择性——同时抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，导致大量未消化的碳水化合物进入结肠，经微生物发酵产生肠道气体和短链脂肪酸，最终引起各种胃肠道不良反应，包括肠胃气胀、腹胀和腹泻。因此，寻找选择性抑制α-葡萄糖苷酶的化合物成为一种更有前景的策略。

多年来，酚类化合物因其已证实的抗糖尿病潜力而受到越来越多的关注。多酚类化合物具有适合作为酶抑制剂的结构特征，包括能够进行π-π相互作用的芳香环，以及可作为氢键供体和受体的多个羟基。黄酮类化合物是多酚类中研究最广泛的一类，查尔酮作为黄酮类化合物的前体，因其结构简单和广泛的药理活性而受到重视。

本研究首次选取了五种查尔酮和十三种结构相关的黄酮类化合物，旨在研究选择性α-葡萄糖苷酶抑制的结构要求。研究首先使用酶学实验进行筛选以确定最有前景的抑制剂，然后利用来源于人肠道上皮的C2BBe1细胞（Caco-2细胞的一个克隆）评估所选化合物对人源α-葡萄糖苷酶的抑制潜力，以评估其在人细胞模型中的相关性。本研究的创新之处不在于评估新的化学实体，而在于建立一种评估α-葡萄糖苷酶抑制剂的转化策略，通过将系统的构效关系（structure-activity relationship, SAR）分析与人类肠道酶模型验证相结合，为常规筛选实验的生理相关性以及选择性α-葡萄糖苷酶抑制剂的识别提供新的见解。该论文发表在《RSC Medicinal Chemistry》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法开展研究。在体外酶学筛选中，利用酵母α-葡萄糖苷酶和猪胰腺α-淀粉酶分别建立酶抑制活性测定体系，以对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-d-glucopyranoside, pNPG）和2-氯-对硝基苯基-α-d-麦芽三糖苷（CNPG3）为底物进行分光光度法检测。为确定抑制机制，采用Michaelis-Menten酶动力学模型和Lineweaver-Burk双倒数作图进行统计分析。在人源酶验证方面，使用人结直肠腺癌细胞系C2BBe1（ATCC? CRL-2102?），经9天分化后制备细胞裂解液作为人源α-葡萄糖苷酶来源，分别以pNPG（合成底物）和麦芽糖（生理性底物）进行活性测定。麦芽糖酶活性采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联比色法测定，同时采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）方法作为替代检测手段以克服多酚类化合物的测定干扰。细胞活力通过MTT比色法评估。

三、研究结果

体外α-葡萄糖苷酶抑制实验

在查尔酮类化合物中，仅二氢查尔酮根皮素（phloretin, A1）表现出α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC₅₀为68 ± 1 μM。其糖基化衍生物根皮苷（phlorizin, A2）在最高测试浓度（200 μM）下未显示抑制活性，表明2′位糖基化导致活性丧失。在黄酮类化合物中，十三种测试化合物中有六种表现出活性。杨梅素（myricetin, F5）和金雀异黄酮（genistein, C）是最有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，IC₅₀分别为14.5 ± 0.6 μM和17 ± 1 μM，两者均显著低于阳性对照阿卡波糖（IC₅₀ = 267 ± 12 μM）。值得注意的是，两者A环5位和7位均存在羟基，凸显了这些位置取代基对α-葡萄糖苷酶抑制活性的重要性。构效关系分析表明，B环上引入邻苯二酚基团不利于黄烷酮类的抑制活性；5′位和5位羟基的存在对黄酮醇类活性至关重要；3′和4′位甲氧基化不利于活性；A环8位羟基的存在也具有相关性。

体外胰腺α-淀粉酶抑制实验

在α-淀粉酶抑制方面，仅圣草酚查尔酮（eriodictyol chalcone, B2）表现出显著抑制活性。漆黄素-3,4′-二甲醚（fisetin-3,4′-dimethylether, F3）是最有效的α-淀粉酶抑制剂，IC₅₀为10.0 ± 0.9 μM，但仍未超过阿卡波糖（IC₅₀ = 0.88 ± 0.03 μM）。B环双甲基化增强了α-淀粉酶抑制活性，B环邻苯二酚基团的存在也有利于抑制。杨梅素在最高测试浓度（25 μM）下对α-淀粉酶无抑制作用，而金雀异黄酮对α-淀粉酶的IC₅₀（153 ± 9 μM）比对α-葡萄糖苷酶高出近九倍，表明其相对选择性。

α-葡萄糖苷酶抑制机制研究

通过Michaelis-Menten动力学模型和Lineweaver-Burk双倒数作图分析，杨梅素和金雀异黄酮均呈现混合型抑制机制（mixed-type inhibition），即抑制剂既可结合酶的活性位点也可结合变构位点，表现为随抑制剂浓度增加，最大反应速率（V_max）降低而米氏常数（K_m）可增可减。相比之下，阿卡波糖表现为竞争性抑制机制，K_m值随抑制剂浓度升高而增加，V_max保持不变。

细胞活力：MTT实验

通过MTT比色法评估了两种最有效的选择性α-葡萄糖苷酶抑制剂及阳性对照阿卡波糖对C2BBe1细胞活力的影响。在10分钟和24小时孵育后，所有测试浓度均未引起细胞活力的显著降低。基于这些结果，选择50 μM（黄酮类化合物）和200 μM（阿卡波糖）作为后续实验的最大非细胞毒性浓度。阳性对照Triton X-100（1%）将细胞活力降至20%以下，验证了方案的可靠性。

使用pNPG作为底物的蔗糖酶-异麦芽糖酶抑制活性

为直接比较两种不同酶源下的抑制活性，研究人员将酵母α-葡萄糖苷酶实验中使用的底物pNPG也用于人源酶实验。尽管杨梅素和金雀异黄酮在酵母酶实验中表现出优于阳性对照的抑制活性，但两者在最高测试浓度（50 μM）下对人源蔗糖酶-异麦芽糖酶均未显示显著活性，而阿卡波糖的IC₅₀为91 ± 3 μM。

麦芽糖酶抑制活性——葡萄糖氧化酶实验

为使用生理性底物麦芽糖评估所选黄酮类化合物对人源α-葡萄糖苷酶的抑制效果，研究人员建立了基于葡萄糖氧化酶-过氧化物酶的测定方法。与之前结果一致，所选黄酮类化合物均未达到50%的酶抑制。然而，杨梅素在6.25 μM浓度下表现出中等抑制活性，将酶活性降低27 ± 3%。但杨梅素会干扰测定反应，可能是通过直接与酶试剂盒组分相互作用或清除反应中产生的过氧化氢，这影响了所测抑制效果的准确性。

GC-MS分析

为克服葡萄糖氧化酶测定的局限性，研究人员采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）方法对反应产物（葡萄糖）进行色谱检测作为替代方案。抑制效果可通过葡萄糖峰面积的减少直接观察到。该方法允许测试更高浓度的杨梅素，在25 μM浓度下，杨梅素抑制酶活性达59 ± 2%，证实了杨梅素对人源α-葡萄糖苷酶具有抑制活性。相比之下，阿卡波糖在较低浓度（12.5 μM）下表现出相当的抑制效果（63 ± 4%）。

四、讨论与结论

在评估的化合物中，仅四种在最高测试浓度下表现出对α-葡萄糖苷酶的选择性抑制活性：根皮素（A1）、柚皮素（D1）、7,8,3′,4′-四羟基黄酮（E3）和杨梅素（F5）。芹菜素（E1）和漆黄素（F2）虽也抑制α-葡萄糖苷酶，但其IC₅₀值与α-淀粉酶相当，缺乏选择性。金雀异黄酮（C）也是值得关注的候选化合物，其对α-葡萄糖苷酶具有第二低的IC₅₀值（17 ± 1 μM），且对α-淀粉酶需要显著更高的浓度（153 ± 9 μM）才能达到50%抑制，表明其对α-葡萄糖苷酶具有优先抑制效应。

在结构特征方面，黄酮类化合物的羟基化增强抑制效力，而甲氧基化和糖基化倾向于降低酶抑制。A环5位羟基的存在对α-葡萄糖苷酶抑制活性至关重要，A环8位羟基也具有相关性，黄酮醇骨架中邻苯二酚基团的存在是有利的。这些结构要求反映了α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶蛋白质结构的根本差异：α-淀粉酶作为内切酶，其催化活性位点位于蛋白质表面宽而浅的沟槽中；而α-葡萄糖苷酶作为外切酶，具有窄而深的催化口袋。

与大多数以往研究一样，化合物最初是针对酵母α-葡萄糖苷酶进行测试的。然而，该模型对人源α-葡萄糖苷酶抑制的预测价值有限，因为酵母酶通常属于GH13糖苷水解酶家族，而人源酶属于GH31家族。尽管两者都催化α-糖苷键的水解并共享(β/α)₈-桶状折叠，但它们在整体结构上差异显著。这些结构差异延伸到活性位点口袋，影响结合亲和力和抑制机制。因此，针对酵母α-葡萄糖苷酶观察到的抑制活性可能无法准确反映对人源酶的抑制。

为弥补这一不足，研究人员使用人源C2BBe1无细胞提取物作为酶源优化了抑制实验。与亲本Caco-2细胞系相比，C2BBe1细胞具有更均匀的刷状缘，肠道酶表达水平更接近人肠上皮细胞，是研究肠道α-葡萄糖苷酶活性的合适模型。值得注意的是，在pNPG实验中，杨梅素和金雀异黄酮在最高测试浓度（50 μM）下对人源酶均无效。通过GC-MS方法，杨梅素在25 μM浓度下实现了超过50%的抑制，证实了其对人源α-葡萄糖苷酶的抑制潜力，尽管效力低于阿卡波糖。然而，杨梅素保留了相对于α-淀粉酶的更高选择性，这一药理学特性可能有助于减少当前α-葡萄糖苷酶抑制剂常见的胃肠道不良反应。

更重要的发现是，酵母和人源α-葡萄糖苷酶抑制之间的显著差异证明，常规筛选实验可能高估候选抑制剂的转化潜力。本研究不仅将构效关系分析扩展到查尔酮类化合物并在人肠道模型中验证了最有前景的化合物，还引入了一种基于GC-MS的方法，克服了评估多酚类化合物时常规葡萄糖氧化酶和分光光度法测定的分析局限性。这些进展为选择性α-葡萄糖苷酶抑制剂的识别和验证建立了更可靠、更具转化性的工作流程。