磷酸盐转运蛋白XPR1促进gasdermin D非依赖的成熟IL-1β分泌

《Journal of Biological Chemistry》：The phosphate exporter XPR1 promotes gasdermin D–independent mature IL-1β secretion

　　

白细胞介素（Interleukin, IL）-1β是一种无信号肽的炎症性细胞因子，不通过经典的内质网-高尔基体途径分泌。相反，成熟（mature, m）IL-1β的分泌经典上与细胞焦亡（pyroptosis）相关，这是一种由gasdermin D（GSDMD）在质膜上形成孔道所介导的caspase依赖性炎症性细胞死亡。然而，人单核细胞可以在不发生细胞死亡的情况下分泌mIL-1β，而GSDMD在该分泌途径中的贡献仍不清楚。 在此，研究人员在存活的人单核细胞中区分了两种mIL-1β分泌途径：一种快速的、GSDMD依赖的途径，以及一种较慢的、GSDMD非依赖的途径。通过全基因组CRISPR-Cas9筛选，研究人员鉴定了XPR1（异嗜性和多嗜性逆转录病毒受体1，Xenotropic and Polytropic retrovirus Receptor 1）作为GSDMD非依赖途径的调节因子。XPR1是后生动物中唯一被鉴定的磷酸盐转运蛋白，此前从未被涉及细胞因子分泌。在GSDMD缺陷的单核细胞中，XPR1的基因失活显著减少了IL-1β的分泌。研究人员进一步证明，这一调节功能需要XPR1的表面表达和磷酸盐输出活性。 这些发现揭示了磷酸盐稳态与非溶解性mIL-1β分泌之间的意外联系，为调节IL-1β驱动的炎症性疾病开辟了新的机遇。

论文解读：磷酸盐转运蛋白XPR1介导gasdermin D非依赖的成熟IL-1β分泌

一、研究背景与科学问题

白细胞介素-1β（IL-1β）是先天免疫应答早期阶段的关键炎症性细胞因子，参与动脉粥样硬化、类风湿关节炎、痛风及2型糖尿病等多种慢性自身炎症性疾病。IL-1β的分泌受多步骤精密调控：首先由微生物或危险相关分子提供第一信号，诱导IL1B基因表达产生31 kDa的无活性前体pro-IL-1β；随后在炎症小体（inflammasome）激活后，caspase-1切割pro-IL-1β生成17 kDa的成熟且具有生物活性的IL-1β（mIL-1β）；最终，无信号肽的mIL-1β通过不依赖内质网-高尔基体的非经典分泌途径释放。

经典观点认为，mIL-1β的分泌与细胞焦亡（pyroptosis）密切相关，该过程由gasdermin D（GSDMD）在质膜上形成孔道介导，最终导致细胞膜破裂和细胞死亡。然而，多个研究团队观察到在无细胞死亡情况下仍可发生IL-1β分泌，包括鼠中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及人单核细胞。人原代单核细胞经脂多糖（LPS）刺激后可在无可检测细胞死亡的情况下分泌mIL-1β，但存活细胞如何分泌mIL-1β的机制尚不完全清楚，GSDMD在此过程中的贡献也存在争议。因此，阐明活细胞中mIL-1β分泌的分子机制具有重要的基础科学和临床转化意义。

二、研究内容与主要结论

本研究利用PMA分化的THP-1人单核细胞系，系统解析了LPS刺激下mIL-1β的分泌机制。研究发现，PMA分化的THP-1细胞经LPS单独刺激24小时后可分泌mIL-1β，且不伴随细胞死亡，成功模拟了原代人单核细胞的特征性行为。该分泌过程依赖NLRP3和caspase-1，但不依赖caspase-4、caspase-5及caspase-8。

通过构建GSDMD基因敲除（GSDMD^-/-）THP-1细胞，研究人员发现GSDMD缺失并不减少mIL-1β的总分泌量，但显著改变了分泌动力学：野生型细胞呈现快速分泌（LPS刺激后2-4小时急剧增加），而GSDMD^-/-细胞分泌缓慢，前8小时分泌极少，伴随细胞内mIL-1β的大量蓄积。分泌效率分析显示，野生型细胞在7小时和24小时的分泌效率分别高达97%和98%，而GSDMD^-/-细胞在7小时仅为5%，24小时升至58%。这些结果证明THP-1细胞存在GSDMD依赖和GSDMD非依赖两条mIL-1β分泌途径。

为进一步鉴定GSDMD非依赖途径的关键分子，研究人员在GSDMD^-/-细胞中进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选，鉴定出XPR1（异嗜性和多嗜性逆转录病毒受体1）为候选基因。XPR1是后生动物中唯一已知的磷酸盐输出蛋白。通过构建GSDMD^-/-XPR1^-/-双敲除细胞，证实XPR1缺失使mIL-1β分泌效率从58%显著降至19%。此外，敲除与XPR1形成复合物并维持其表面定位的KIDINS220同样降低分泌效率（30% vs 58%），表明XPR1的细胞表面表达对其功能至关重要。

研究人员进一步通过CRISPR介导的同源定向修复技术，在内源XPR1位点引入已知的磷酸盐输出功能缺陷突变（L218S及KSC突变），发现这些突变同样显著降低mIL-1β分泌效率，证明XPR1的磷酸盐输出活性是其调节IL-1β分泌所必需的。在无磷酸盐培养基条件下，XPR1缺陷细胞的mIL-1β分泌显著恢复，进一步证实磷酸盐稳态参与调控该分泌过程。

三、主要关键技术方法

本研究采用以下核心技术方法：1）PMA诱导THP-1细胞分化模型，模拟人原代单核细胞功能；2）CRISPR-Cas9基因编辑技术构建基因敲除及点突变细胞系，包括GSDMD、XPR1、KIDINS220单敲及双敲细胞，以及通过同源定向修复引入XPR1功能缺陷突变；3）全基因组CRISPR Brunello文库筛选结合流式细胞分选（FACS）鉴定关键调控基因；4）ELISA定量检测分泌及细胞内mIL-1β水平；5）细胞毒性评估体系（LDH释放、CellTox Green摄取、MTS/PMS代谢活性检测）；6）免疫印迹（Western blot）验证蛋白表达及切割；7）免疫荧光及流式细胞术检测XPR1表面表达。

四、研究结果

1. LPS刺激的THP-1细胞在不发生焦亡的情况下分泌成熟IL-1β

PMA分化的THP-1细胞经LPS刺激24小时后可分泌mIL-1β，且无可检测的细胞死亡（LDH释放无显著增加、CellTox Green染色阳性细胞比例低、代谢活性无显著降低）。作为阳性对照，尼日利亚霉素（nigericin）处理可诱导强烈的焦亡性细胞死亡。该分泌依赖NLRP3和caspase-1，但不依赖caspase-4/5/8。

2. PMA处理的LPS刺激THP-1细胞的成熟IL-1β分泌不依赖GSDMD

GSDMD^-/- THP-1细胞经LPS刺激后mIL-1β分泌总量与野生型相当，但动力学显著不同：野生型快速分泌且无细胞内蓄积，GSDMD^-/-细胞分泌缓慢且伴随大量细胞内mIL-1β蓄积。分泌效率在7小时和24小时分别为5%和58%，远低于野生型的97%和98%。GSDMD缺失不影响经典分泌途径（IL-1RA分泌正常）。

3. 全基因组CRISPR筛选鉴定XPR1为GSDMD非依赖途径的调节因子

在GSDMD^-/- THP-1细胞中进行的全基因组CRISPR筛选，以细胞内mIL-1β蓄积为筛选指标，XPR1在三个独立重复实验中均为显著富集基因。XPR1是普遍表达的多跨膜表面蛋白，为后生动物中唯一已知的磷酸盐输出蛋白。

4. XPR1通过磷酸盐输出功能正向调控GSDMD非依赖的IL-1β分泌

GSDMD^-/-XPR1^-/-双敲除细胞分泌效率显著降低（19% vs 58%）。KIDINS220敲除导致XPR1表面表达缺失，同样降低分泌效率（30% vs 58%）。携带磷酸盐输出功能缺陷突变（L218S、KSC）的XPR1细胞分泌效率与XPR1敲除细胞相当。在无磷酸盐培养基中，XPR1缺陷细胞的mIL-1β分泌显著恢复，而GSDMD^-/-细胞无此效应。

五、讨论与结论

本研究揭示了人单核细胞中mIL-1β分泌的两条独立途径：快速的GSDMD依赖途径和较慢的GSDMD非依赖途径。GSDMD依赖途径可能涉及细胞内GSDMD孔道活性而非质膜孔道，因为未检测到CellTox Green摄取。XPR1的发现建立了磷酸盐稳态与非经典细胞因子分泌之间的全新联系。

基于结构生物学研究，XPR1形成二聚体膜转运蛋白，其磷酸盐传导通道最大直径约6-8 ?，足以容纳无机磷酸盐离子但无法通过mIL-1β等大分子，因此XPR1不太可能直接转运IL-1β。研究人员提出肌醇焦磷酸盐（inositol pyrophosphates）可能构成联系磷酸盐稳态与IL-1β分泌的分子桥梁：细胞内无机磷酸盐水平升高促进5-InsP₇和1,5-InsP₈的合成，后者结合XPR1的SPX结构域激活磷酸盐输出；XPR1功能缺陷导致磷酸盐和肌醇焦磷酸盐蓄积，进而抑制mIL-1β分泌。

本研究的结论是：人单核细胞通过GSDMD依赖和GSDMD非依赖两条途径分泌mIL-1β，其中GSDMD非依赖途径需要磷酸盐输出蛋白XPR1及其表面表达和磷酸盐输出活性。这些发现揭示了磷酸盐稳态与IL-1β非经典分泌之间的意外联系，为理解IL-1β驱动的炎症性疾病提供了新的视角，并为开发新型抗炎治疗策略开辟了潜在靶点。该研究发表在《Journal of Biological Chemistry》。