遗传与生化筛选鉴定MGAT1为STK11突变肺癌中可成药的糖基转移酶靶点

《Journal of Biological Chemistry》：Genetic and biochemical screens identify MGAT1 as a druggable glycosyltransferase target in STK11-mutant lung cancer

　　

中文摘要翻译： 免疫检查点抑制剂是非小细胞肺癌（NSCLC）的标准治疗方案，但其在携带STK11突变的肿瘤中疗效受限，这凸显了对新治疗策略的需求。研究人员通过互补的体内和体外CRISPR-Cas9功能基因组筛选，鉴定了其缺失能够恢复抗PD-1治疗敏感性的基因。研究发现，MGAT1（一种对高甘露糖型N-聚糖成熟为杂合型和复杂型聚糖结构至关重要的高尔基体糖基转移酶）的缺失，在携带STK11突变的同系小鼠肿瘤模型中逆转了对抗PD-1治疗的耐药性。平行的抗原匹配CD8+T细胞共培养筛选进一步表明，N-糖基化的破坏能强烈增敏肿瘤细胞对T细胞介导杀伤的敏感性。遗传回补研究表明，这种免疫逃逸表型依赖于MGAT1的催化活性，支持对该酶进行直接的生化探究。研究人员利用纯化的人MGAT1和UDP-Glo?糖基转移酶检测体系，建立了可行的筛选平台，并进行了50万化合物的生化高通量筛选，鉴定出初始命中化合物（化合物1；IC50 = 197 μM）。随后的药物化学优化产生了效力逐步增强的类似物，包括TNG-9333（0.814 μM）和TNG-2673（0.043 μM），相较起始命中化合物实现了超过1000倍的生化效力提升。人MGAT1在脱辅基、UDP结合、UDP-GlcNAc结合及抑制剂结合状态下的晶体结构，结合SPR和DSF分析，揭示了该化学系列结合一个此前未被识别的变构口袋，并通过UDP非竞争性机制抑制MGAT1。综上所述，研究人员的工作将N-糖基化确立为免疫逃逸的关键介质，并将MGAT1确立为一个具有配体可及性、结构可操作性的小分子药物发现靶点。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors）已显著改善了非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗格局，但仍有大量患者无法从中获益。STK11功能缺失突变见于15-20%的NSCLC病例，在其他癌种中频率较低，且与免疫检查点抑制剂治疗反应降低相关。临床前模型研究一致表明，STK11功能缺失与较低的T细胞浸润、较高水平的免疫抑制性中性粒细胞、减弱的STING信号以及降低的抗原呈递相关。因此，寻找能够克服STK11驱动的免疫逃逸的新型治疗靶点，是当前肿瘤免疫治疗领域的迫切需求。

功能基因组筛选是发现新药物靶点的有力手段。研究人员此前在经典抗PD-1敏感的MC38同系小鼠模型中进行了体内CRISPR-Cas9筛选，发现STK11敲除导致肿瘤生长加快并对抗PD-1阻断产生耐药。进一步研究发现HDAC1敲除可逆转STK11驱动的抗PD-1耐药，最终促成了CoREST复合物抑制剂TNG260进入I期临床试验。这一成果激励了研究人员继续寻找机制上不同、能够克服STK11驱动免疫逃逸的额外靶点。

二、研究内容与主要发现

本研究综合运用体内和体外CRISPR筛选，鉴定出甘露糖基（α-1,3-）糖蛋白β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（MGAT1）作为STK11突变肿瘤及更广泛实体瘤中重要的肿瘤内在免疫逃逸调节因子。MGAT1是一种高尔基体糖基转移酶，催化UDP-GlcNAc将N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）转移至高甘露糖型N-聚糖的α-1,3-连接甘露糖残基上，是复杂N-聚糖链成熟的关键步骤。研究证实MGAT1敲除足以在体内克服STK11驱动的适应性免疫耐药，且该免疫逃逸表型依赖于MGAT1的酶活性。研究人员建立了生化高通量筛选平台，鉴定了首个MGAT1变构抑制剂，并通过药物化学优化、生物物理分析和结构研究定义了可操作的结合口袋。这些发现确立了MGAT1作为肿瘤内在免疫逃逸介质和可进行小分子药物开发的生化可操作糖基转移酶靶点。该论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了多项关键技术：体内CRISPR-Cas9功能基因组筛选，在MC38同系小鼠模型中鉴定在STK11敲除背景下特异性耗竭的基因；体外全基因组CRISPR共培养筛选，使用健康供者来源的原代人CD8⁺T细胞（经NYESO1 TCR转导）与NCI-H1703肿瘤细胞共培养；UDP-Glo?糖基转移酶生化检测体系，以3α,6α-甘露五糖为替代底物测定MGAT1催化活性；50万化合物高通量筛选；表面等离子体共振（SPR）和差示扫描荧光法（DSF）进行生物物理验证；X射线晶体学解析人MGAT1多种配体结合状态的高分辨率结构；基于质谱的糖蛋白组学分析（检测到2906个糖基化肽段，映射至524个独特蛋白）；流式细胞术凝集素染色（PHA-L和GNA）验证N-聚糖变化；体内同系小鼠肿瘤模型和过继性T细胞转移模型（NOG小鼠皮下A375异种移植）。

四、研究结果

（一）体内CRISPR筛选鉴定MGAT1敲除为STK11缺陷肿瘤的免疫增敏因子

研究人员在MC38野生型和STK11敲除细胞中进行了靶点发现筛选，寻找在STK11敲除细胞经抗PD-1处理后相对于裸鼠中敲除细胞和经抗PD-1处理的野生型细胞选择性耗竭的引导序列。两个比较中的首要命中基因均为MGAT1。文库中四个MGAT1靶向sgRNA中有三个在sgSTK11背景下显示优先耗竭，且耗竭幅度随免疫压力增加而增大。单基因敲除验证实验证实，MGAT1敲除在sgSTK11背景下特异性抑制肿瘤生长，并能增强STK11缺陷肿瘤对抗PD-1阻断的敏感性。

（二）共培养CRISPR筛选将N-糖基化与抗原特异性T细胞介导杀伤耐药联系起来

研究人员建立了基于原代人CD8⁺T细胞（表达NYESO1 TCR）与HLA-A*02:01+/NYESO1+肿瘤细胞共培养的全基因组CRISPR筛选体系。筛选恢复了许多已知的T细胞介导杀伤调节因子，其中大量增敏基因（包括MGAT1）调节细胞表面糖基化，涵盖N-糖基化通路的多个步骤，包括前体糖生物合成酶、将底物转运至内膜系统的转运蛋白以及构建聚糖链的糖基转移酶。MGAT1因编码潜在可成药酶、占据通路中复杂N-聚糖合成限速步骤的关键上游位置而被优先选择。

（三）MGAT1缺失在体外和体内增敏人肿瘤模型对T细胞介导杀伤的敏感性

靶向共培养竞争实验表明，MGAT1敲除以效应细胞与靶细胞（E:T）比例依赖的方式增敏STK11野生型NCI-H1703和STK11突变型NCI-H1755细胞对NYESO1 TCR⁺CD8⁺T细胞介导杀伤的敏感性。在NOG小鼠A375异种移植过继细胞转移模型中，MGAT1敲除显著增强了肿瘤对T细胞介导杀伤的体内敏感性，而基线肿瘤生长相当。

（四）MGAT1敲除阻断复杂N-聚糖成熟并改变免疫效应分子PD-L1和CD73的糖基化

MGAT1敲除细胞PHA-L（结合分支复杂N-聚糖）结合降低，GNA（优先结合高甘露糖型N-聚糖）结合增加，证实通路调节。基于质谱的糖蛋白组学分析（检测到2906个糖基化肽段，映射至524个独特蛋白）的主成分分析显示MGAT1敲除与NTC样本间清晰分离。免疫印迹分析显示PD-L1和CD73出现分子量凝胶迁移，与成熟糖基化水平改变一致。

（五）生化和结构研究定义人MGAT1催化位点

研究人员表达并纯化了MGAT1腔结构域（T30-N445），利用UDP-Glo?检测体系测定酶活性。解析了人MGAT1脱辅基（1.7 ?）、UDP结合（1.6 ?）和UDP-GlcNAc结合（2.0 ?）状态的晶体结构。UDP通过H188、D142、I185、I111、V319、S320、R115及催化必需的锰离子（八面体配位，与D211侧链氧配位）协调结合。D289被定位为催化碱基，D211是DXD基序中直接协调Mn²⁺的残基。D211A、D289A及双突变体均显示酶活性显著丧失，证实两者对催化至关重要。

（六）MGAT1催化活性为免疫逃逸表型所必需

在NCI-H1703 MGAT1敲除细胞中回补CRISPR抗性野生型MGAT1可恢复PHA-L结合和T细胞杀伤耐药性，而催化失活突变体无法回补。在MC38细胞中，经三步基因工程（MGAT1敲除单克隆、STK11敲除、CRISPR抗性野生型或催化失活cDNA回补）后植入免疫活性小鼠，仅野生型MGAT1 cDNA能恢复MGAT1/STK11双敲除细胞的生长优势。MGAT1催化活性在体内外对保护癌细胞免受免疫攻击均至关重要。

（七）高通量筛选和药物化学鉴定出强效MGAT1抑制剂

在50万化合物的UDP-Glo?高通量筛选中，化合物1（IC₅₀ = 197 μM）作为初始命中。通过"甲基行走"策略、吡啶环扩展为喹啉、苯胺环极性官能团引入及三唑部分二甲基取代等迭代优化，最终获得TNG-2673（IC₅₀ = 0.043 μM），相较起始命中实现超过1000倍效力提升。平行药物化学工作通过三唑生物电子等排替换和苯胺苯环转化为吡啶环获得TNG-9333（IC₅₀ = 0.814 μM），保留高溶解度和低体外代谢清除率。生化活性与SPR结合亲和力良好相关。

（八）生物物理和结构分析揭示新型变构口袋和UDP非竞争性抑制

SPR实验表明饱和浓度的抑制剂不显著影响UDP结合亲和力，反之亦然，提示两者独立结合于不同位点。DSF实验显示UDP和抑制剂单独均增加MGAT1热稳定性，两者联合时稳定效应叠加，与非竞争性结合一致。MGAT1-TNG-9333复合物晶体结构揭示了一个远离活性位点的新型结合口袋，由β-转角L407-R413、α-螺旋R391-L401和蛋白C末端形成。TNG-9333的喹啉环通过疏水相互作用夹在G390和W437之间，并与G439骨架氧及保守水分子形成氢键。MGAT1-UDP-TNG-9333三元复合物结构证实两分子可同时结合于不同位点。

五、讨论与结论

本研究鉴定MGAT1为肿瘤内在免疫逃逸介质，尤其在STK11突变癌症背景下，并确立其催化活性为该表型所必需。STK11缺失可能通过代谢重编程增加UDP-GlcNAc的可用性，从而产生对N-糖基化作为免疫逃逸机制的独特依赖性。体外筛选发现广谱细胞表面糖基化相关基因敲除可增敏肿瘤细胞对免疫攻击的敏感性，与聚糖和聚糖结合蛋白在免疫识别中的既定作用一致。MGAT1作为N-聚糖合成途径中复杂聚糖成熟的关键限速酶，其抑制可对细胞表面聚糖产生比下游靶点更深远的影响，同时可能避免非癌细胞毒性。此外，N-糖基化也被认为限制免疫细胞内在活性，MGAT1抑制可能产生双重效应：增敏肿瘤细胞对免疫攻击的同时增强免疫细胞自身效力。

研究人员通过生化高通量筛选和迭代药物化学优化，结合高分辨率晶体结构指导，实现了相较初始命中超过1000倍的效力提升，获得纳摩尔级MGAT1抑制剂。结构研究揭示化合物结合一个此前未被识别的变构位点，与UDP结合活性位点不同，生物物理分析确认为UDP非竞争性作用机制，这一特性可能提供相对于该类其他酶的选