《Journal of Biological Chemistry》：Mammalian DNA methyltransferases in DNA methylation and imprinted gene expression in extraembryonic ectoderm of post-implantation embryos
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哺乳动物的DNA甲基化主要由三种DNA甲基转移酶（DNMTs）催化。传统上，DNMT1被认为是负责维持性DNA甲基化的主要DNMT蛋白，而DNMT3A和DNMT3B则执行从头DNA甲基化功能。在先前两项研究中，研究人员证明DNMT3A和DNMT3B在胚胎干细胞
哺乳动物的DNA甲基化主要由三种DNA甲基转移酶（DNMTs）催化。传统上，DNMT1被认为是负责维持性DNA甲基化的主要DNMT蛋白，而DNMT3A和DNMT3B则执行从头DNA甲基化功能。在先前两项研究中，研究人员证明DNMT3A和DNMT3B在胚胎干细胞（ES细胞）和植入后胚胎的上胚层中维持全基因组范围的DNA甲基化。有趣的是，DNMT3A和DNMT3B也在植入后胚胎的胚外外胚层（EXE）中维持全基因组DNA甲基化，包括重复序列、基因区和基因间区。尽管DNMT1在维持印记区域印记控制区（ICRs）的DNA甲基化中发挥主要作用，但在EXE中，DNMT3A和DNMT3B对于维持一部分印记区域ICRs的DNA甲基化也是必需的，这与在ES细胞和上胚层中的观察结果相似。令人惊讶的是，由DNMT3A和DNMT3B介导的从头DNA甲基化导致大部分印记区域的DNA甲基化水平升高。这些结果与研究人员之前在植入后胚胎上胚层中阐明的发现一致。重要的是，由于缺乏DNMT1或两种DNMT3蛋白而导致印记区域ICR处DNA甲基化的丧失，会引起该印记区域相应印记基因的等位基因表达转换。本研究提供了进一步证据，表明DNMT3A和DNMT3B在植入后胚胎的全基因组范围内同时发挥维持性和从头DNA甲基化功能。研究还验证了之前关于DNA甲基化依赖性印记基因等位基因表达转换的一些发现。
一、研究背景与科学问题
DNA甲基化是哺乳动物表观遗传调控的核心机制之一，主要发生在CpG二核苷酸位点。在哺乳动物中，DNA甲基化主要由三种DNA甲基转移酶（DNMTs）——DNMT1、DNMT3A和DNMT3B催化。传统观点认为，DNMT1主要负责维持性DNA甲基化，即在DNA复制后将甲基化模式传递给子链；而DNMT3A和DNMT3B则负责从头DNA甲基化，即在未甲基化的DNA上建立新的甲基化标记。然而，近年来多项研究表明，这种功能划分并非绝对。例如，DNMT3A和DNMT3B在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）和植入后胚胎的上胚层中也参与维持全基因组范围的DNA甲基化。此外，基因组印记是一种依赖于亲本来源的单等位基因表达现象，由印记控制区（ICRs）上的差异甲基化区域（DMRs）调控。ICR处的DNA甲基化在配子发生期间建立，受精后需被精确维持以保证印记基因的正确单等位基因表达。目前尚不清楚DNMT1、DNMT3A和DNMT3B这三种DNMT蛋白如何在植入后胚胎的胚外外胚层（EXE）中协同调控全基因组DNA甲基化以及印记基因的亲本特异性表达。因此，本研究旨在系统解析这三种DNMT蛋白在EXE组织中对DNA甲基化维持和从头建立的双重功能，及其对印记基因表达的调控作用。
二、研究方法概述
研究人员利用已发表的两项研究数据，分析了来自植入前E3.5胚胎滋养外胚层（TE）以及植入后E6.5或E7.5胚胎胚外外胚层（EXE）的DNA甲基化数据。通过比较野生型（WT）、Dnmt1敲除（Dnmt1 KO）、Dnmt3a和Dnmt3b双敲除（Dnmt3 DKO）以及Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b三敲除（Dnmt TKO）突变体胚胎的EXE样本，采用全基因组亚硫酸氢盐测序技术定量分析CpG位点的甲基化水平。同时，利用RNA测序（RNA-seq）检测印记基因的表达变化，并通过DESeq2进行差异表达分析。研究涉及的基因组区域包括重复序列、逆转录病毒元件、基因区（启动子、外显子、内含子）、基因间区、CpG岛（CGIs）以及24个已知印记区域的ICRs和相关体细胞DMRs（sDMRs）。
三、研究结果
1. 基因区和基因间区的DNA甲基化
研究发现，从E3.5到E6.5/E7.5，EXE中全基因组DNA甲基化水平从约20%显著上升至约50%-60%。这一增加在Dnmt3 DKO突变体中完全消失，表明DNMT3A和DNMT3B介导的从头甲基化是其主要原因。在基因区（启动子、外显子、内含子）和基因间区中，Dnmt3 DKO突变体不仅丧失了新增的甲基化，甚至低于E3.5 TE的水平，说明DNMT3A和DNMT3B还参与了维持预先存在的DNA甲基化。
2. 重复序列和逆转录病毒元件的DNA甲基化
在大多数重复序列（如LINE、SINE、LTR、DNA重复、卫星重复）中，EXE中DNA甲基化显著增加，该增加在Dnmt3 DKO突变体中消除。在Simple repeat和Low complexity区域，DNMT3A和DNMT3B同样表现出维持预先存在甲基化的功能。三种DNMT蛋白在这些区域的功能呈互补关系。
3. CpG岛和标志基因的DNA甲基化
CpG岛（CGIs）在EXE中甲基化水平较低但仍有增加，且该增加依赖DNMT3A和DNMT3B。多能性标志基因Oct4和Nanog在EXE中被重新甲基化，此过程完全依赖DNMT3A和DNMT3B。此外，在Nanog基因上，DNMT3A和DNMT3B还负责维持新获得的甲基化。分化标志基因Gata4、Gata6和Cdx2也显示出类似的DNMT依赖性甲基化模式。
4. 超过半数印记区域的ICR甲基化主要由DNMT1维持
在24个已知印记区域中，有14个ICRs（如Snrpn、Mcts2等）的DNA甲基化在Dnmt1 KO突变体中显著丢失，而在Dnmt3 DKO中基本不变，表明DNMT1是这些ICRs的主要维持者。在这些区域中，ICR甲基化丢失导致相应印记基因发生等位基因表达转换，例如H13表达下降而Mcts2表达上升，符合DNA甲基化依赖性等位基因表达转换模型。
5. 七个印记区域在植入后EXE中出现DNA甲基化增加
在7个ICRs（包括Peg3、Peg5、Slc38a4、H19、AK008011、Gpr1和Nespas）中，EXE中DNA甲基化水平显著高于E3.5 TE，这种增加在Dnmt3 DKO中消除，表明是由DNMT3A和DNMT3B介导的从头甲基化所致。DNMT1仍是这些ICRs的主要维持者，但DNMT3A和DNMT3B也在其中两个ICRs（Slc38a4和AK008011）中协助维持。以H19 ICR为例，其甲基化丢失导致H19表达上升、Igf2表达下降，再次验证了等位基因表达转换模型。
6. 三个印记区域的ICR甲基化由DNMT3蛋白维持
在Peg10、Gnas1A和Dlk1-Meg3印记区域的IG-DMR这三个ICRs中，Dnmt3 DKO突变体导致DNA甲基化显著降低，表明DNMT3A和DNMT3B参与了这些ICRs预先存在甲基化的维持。在Dlk1-Meg3区域，ICR甲基化丢失导致Dlk1表达下降，而Meg3、Rian和Mirg表达上升，符合等位基因表达转换模型。
7. 印记区域体细胞DMRs（sDMRs）的DNA甲基化
许多sDMRs在EXE中同样出现DNMT3A和DNMT3B依赖性的DNA甲基化增加。此外，DNMT3A和DNMT3B还参与维持这些sDMRs中新获得的和预先存在的甲基化。
四、讨论与研究结论
本研究证实，DNMT3A和DNMT3B在植入后胚胎的EXE中不仅执行经典的从头DNA甲基化功能，还广泛参与维持性DNA甲基化，覆盖重复序列、基因区、基因间区、CpG岛以及印记控制区等多个基因组层面。这与研究人员此前在上胚层中的发现高度一致，进一步确立了DNMT3蛋白在维持基因组甲基化稳态中的关键地位。值得注意的是，不同ICRs对DNMT1和DNMT3蛋白的依赖性存在差异，提示ICR甲基化维持机制的多样性。此外，ICR甲基化的丢失会引发印记基因的等位基因表达转换，这为DNA甲基化依赖性印记调控模型提供了有力证据。本研究发表在《Journal of Biological Chemistry》。
研究结论翻译如下：本研究提供了进一步证据，表明DNMT3A和DNMT3B在植入后胚胎的全基因组范围内同时发挥维持性和从头DNA甲基化功能。它还验证了之前关于DNA甲基化依赖性印记基因等位基因表达转换的一些发现。
