《Journal of Cereal Science》：Pyramiding gene-edited
GluA3 and
GluC with the
lgc1 locus influences seed storage proteins and growth in rice
编辑推荐：
•通过CRISPR/Cas9编辑的GluA3和GluC与水稻中的自然lgc1等位基因进行基因聚合。•突变体中谷蛋白降至1.59%，潜在可消化蛋白降至3.28%。•潜在可消化蛋白降至低于LGC-1典型的约4%水平。•分蘖数和每株谷粒产量增加；发芽率保持在94%以上。引言水稻是全
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通过CRISPR/Cas9编辑的GluA3和GluC与水稻中的自然lgc1等位基因进行基因聚合。
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突变体中谷蛋白降至1.59%，潜在可消化蛋白降至3.28%。
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潜在可消化蛋白降至低于LGC-1典型的约4%水平。
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分蘖数和每株谷粒产量增加；发芽率保持在94%以上。
引言
水稻是全球超过一半人口的主食，为世界上最贫困的许多人提供了高达50%的膳食热量摄入（Sasaki和Burr, 2000）。因此，水稻是全球最重要的粮食作物之一，尤其是在亚洲地区。水稻不仅是碳水化合物的主要来源，也是人类饮食中植物蛋白的重要来源。在水稻籽粒中，淀粉是最丰富的营养组分，其次是种子储存蛋白（SSP），约占种子总重的10%至12%（Safdar等, 2023）。根据在不同溶剂中溶解度的差异，种子储存蛋白可分为四类：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白（Kawakatsu等, 2008；Saito等, 2012）。其中，谷蛋白的含量最高，占总蛋白的60%至80%（He等, 2021）。谷蛋白由一个包含15个成员的多基因家族编码，系统发育学上分为四个亚家族：GluA、GluB、GluC和GluD（Kawakatsu等, 2008；Okita等, 1989）。GluA和GluB亚家族包含的成员最多，分别包含3个和7个基因（He等, 2021）。
在水稻胚乳中，种子储存蛋白沉积于两种形态迥异的蛋白体（PB）中。谷蛋白是主要的种子储存蛋白，而醇溶蛋白是第二丰富的组分，约占胚乳总蛋白的20–30%（He等, 2021）。醇溶蛋白是一类分子量为10–16 kDa的醇溶蛋白，由多基因家族编码，包含三个亚类：10 kDa、13 kDa富含半胱氨酸醇溶蛋白和13 kDa半胱氨酸贫乏醇溶蛋白（Saito等, 2012）。醇溶蛋白富含脯氨酸和谷氨酰胺残基，人类难以消化。醇溶蛋白保留在内质网（ER）腔内，在此直接组装成较小的、球形的、电子透亮的PB-I蛋白体（Chen等, 2019；Kawakatsu等, 2010）。相比之下，谷蛋白富含谷氨酰胺和天冬酰胺残基，人类相对易于消化。谷蛋白首先在内质网上合成57 kDa前体，然后通过高尔基体运输至蛋白储存液泡，在此被蛋白酶切割为37–39 kDa酸性亚基和22–23 kDa碱性亚基，这些亚基凝聚为较大的、不规则的、电子致密的PB-II蛋白体（Ren等, 2014）。值得注意的是，当谷蛋白积累受损时，醇溶蛋白常发生代偿性上调。
这一探索始于日本，开发了第一个低谷蛋白水稻品种LGC-1，其谷蛋白含量显著降低，同时醇溶蛋白和氨基酸L-脯氨酸的水平升高（Iida等, 1993）。随后，日本研究人员利用LGC-1对慢性肾脏病（CKD）患者进行了临床试验，取得了令人鼓舞的结果（Mochizuki和Hara, 2000）。在此基础上，通过标记辅助选择与LGC-1和优良粳稻品种越光（Koshihikari）间的回交筛选杂交，随后开发了低谷蛋白品种W3660（Wan等, 2004）。
CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术的出现，大幅加速了低谷蛋白水稻种质资源的开发。该技术能够同时在优良品种中破坏多个谷蛋白编码基因，从而获得谷蛋白含量显著降低的非转基因品系。近期研究表明，同时编辑多个谷蛋白基因可以显著降低水稻中谷蛋白的积累，并获得有前景的低谷蛋白种质资源（Chen等, 2022；Yang等, 2022；Wakasa等, 2024）。然而，这种谷蛋白扰动的农艺后果在不同遗传背景和编辑策略间可能存在差异。虽然在一些谷蛋白编辑材料中观察到谷粒重量大幅降低、淀粉积累改变和胚乳垩白度增加等现象（Chandra等, 2023），但其他多基因谷蛋白编辑品系对产量相关性状的影响相对有限（Chen等, 2022）。这些发现表明，在实现谷蛋白含量大幅降低的同时保持优良的农艺表现，仍然是低谷蛋白水稻种质资源育种应用面临的重要挑战。以往的多基因编辑研究有意避开了相邻的GluB4/GluB5基因对，以防止整个谷蛋白基因家族的沉默（Yang等, 2022），而我们则利用了这种沉默效应：将传统基因聚合与CRISPR/Cas9介导的基因组编辑相结合，将自然存在的lgc1等位基因与选定的CRISPR/Cas9编辑谷蛋白等位基因聚合。我们系统评估了这些等位基因组合对种子储存蛋白组成和一系列农艺性状的影响，旨在开发农艺表现更优良的低谷蛋白水稻种质资源。
在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9技术，以优良粳稻品种嘉华1号（JH1）及其含lgc1基因的近等基因系YSD1为转化受体，分别针对GluA3和GluC进行编辑，获得了两个非转基因突变体品系，分别命名为glua3和gluc/lgc1。随后，两个突变体品系进行杂交，聚合多个编辑的谷蛋白基因（glua3/gluc/lgc1）。此外，我们阐明了多基因聚合编辑谷蛋白基因对水稻种子储存蛋白含量、组成比例及重要农艺性状的影响。
章节摘要
植物材料与生长条件
选用两个粳稻品种嘉华1号（JH1）及其含lgc1基因的近等基因系YSD1进行遗传转化和基因组编辑。所有非转基因水稻植株在上海（北纬31°11′，温带气候）夏季（5月中旬播种，6月中旬移栽，10月初收获）和海南（北纬18°16′，亚热带气候）冬季（11月中旬播种，12月中旬移栽，收获
水稻glua3/gluc/lgc1新突变体的培育
为聚合多个谷蛋白基因突变，我们首先通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑获得两个突变体。glua3突变体通过在优良品种嘉华1号中靶向GluA3获得，gluc/lgc1突变体通过在携带lgc1等位基因的YSD1中靶向GluC获得（Kusaba等, 2003）。为进行后续基因聚合，我们有意选择了在靶位点带有大片段缺失的突变等位基因。显著的条带迁移使纯合、杂合以及
谷蛋白缺陷突变体中的差异性代偿响应
既往研究已证实，一种或多种种子储存蛋白组分的积累减少可触发其他种子储存蛋白组分的代偿性转录上调（Kawakatsu等, 2010）。然而，这种代偿响应在不同种子储存蛋白家族中的分布并不均匀。通过对开花后20天发育中胚乳中19个种子储存蛋白相关基因的转录水平进行谱分析，我们在glua3/gluc/lgc1突变体、其亲本品系和野生型品种中观察到两种截然不同的响应模式（
结论
在本研究中，通过将CRISPR/Cas9介导的GluA3和GluC编辑与lgc1位点通过杂交聚合，培育了一种新型超低谷蛋白水稻品系glua3/gluc/lgc1。该品系的潜在可消化蛋白含量降至3.28%，远低于LGC-1典型的约4%水平，而醇解蛋白作为代偿性响应增加。谷蛋白缺陷主要源于lgc1介导的谷蛋白基因家族范围的基因沉默以及靶标基因的定向破坏
CRediT作者贡献声明
董艳君：撰写 – 审阅与编辑、可视化、验证、监督指导、资源、项目管理、方法学、资金获取、形式分析、数据管理、概念设计。林冬智：撰写 – 审阅与编辑、可视化、验证、监督指导、资源、项目管理、方法学、资金获取、形式分析、数据管理、概念设计。张由泽：撰写 – 初稿、可视化、验证、软件、方法学、
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
基金资助
本工作得到上海市科学技术委员会（项目编号：24N22800100, 19391900200）、上海市农业科研体系（项目编号：202003）和浙江省台州市科学技术局（项目编号：23ny18）的资助。资助方未参与研究设计、数据收集、分析和解释、报告撰写，也未参与提交决定。
利益冲突声明
? 作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
感谢中国华南农业大学的刘耀光先生慷慨提供CRISPR/Cas9载体。
张由泽|杨瑞芳|柏永康|戴文照|林冬智|董艳君
