蛋白质在拥挤环境中的自组装

《Journal of Colloid and Interface Science》：Protein self-assembly in crowded environments

　　

蛋白质和核酸、多肽等生物大分子在细胞环境中普遍存在，并在维持结构和功能组织方面发挥着关键作用。近年来，研究者日益关注这些组分如何通过局部液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）实现细胞区室化与组织化。此外，理解蛋白质在拥挤环境中的自组装对医学领域构成重要挑战。首先，阿尔茨海默病和帕金森病等蛋白质错误折叠疾病在老龄化人口中日益常见，这些疾病由错误的蛋白质自组装驱动，导致不溶性纤维状聚集体（即淀粉样斑块或路易小体）的形成。其次，新批准的药物中生物制剂（如抗体、蛋白质或多肽）占比不断增加（2022年已达40.5%），有效使用和稳定储存均依赖于对相分离的精准控制。蛋白质相稳定性及蛋白质组装体的性质也是材料科学和食品科学的核心议题，例如在将植物蛋白纳入更广泛的食品体系的同时保持理想质构和稳定性。在驱动相分离的多种机制中，耗散相互作用（depletion interaction）——一种由拥挤剂排空产生的熵吸引力——已成为拥挤环境中蛋白质自组装的关键贡献因素。非吸附性拥挤剂（如聚合物）不会在蛋白质表面积累。Asakura–Oosawa和Vrij的经典工作首次为耗散相互作用提供了理论解释。当聚合物与蛋白质之间无净吸引时，球状蛋白质周围会形成聚合物耗尽区。当相邻球状蛋白质的耗尽区重叠时，胶体颗粒与溶液本体之间产生不平衡渗透力，将颗粒推挤在一起。因此，即使体系中所有相互作用均为排斥性，非吸附聚合物仍能诱导胶体颗粒间的有效吸引。近几十年来，胶体-聚合物混合物中耗散相互作用的理解取得了显著进展，但文献主要聚焦于聚合物尺寸（显著）小于胶体颗粒的情形。尽管耗散相互作用提供了拥挤环境中去混溶的主导熵驱动力，静电作用力则引入额外的、通常与之竞争的贡献。除耗散相互作用外，静电或双电层相互作用也显著影响蛋白质溶液的相稳定性。蛋白质的净电荷及周围介质的离子强度决定了双电层力的范围和大小，该作用力既可稳定也可去稳定凝聚相。离子强度增加会减小Debye屏蔽长度，从而削弱静电排斥并促进相分离；反之，在低盐条件下，强静电排斥可抑制去混溶。因此，吸引性与排斥性静电贡献之间的平衡在决定蛋白质溶液的相稳定性和结构性质方面起着重要作用。然而，从理论上捕捉这种平衡仍具挑战。对拥挤剂-蛋白质体系进行定量描述并不简单，因为这需要同时考虑静电作用、多体耗散相互作用以及可能的特异性分子相互作用。理论处理常依赖简化假设（如对势近似），但众所周知，由于耗散相互作用的多体本质，对势或有效势理论不能正确捕捉体系的宏观热力学性质。因此，定量预测带电且拥挤的蛋白质溶液中的相行为仍然困难。当聚合物拥挤剂尺寸与蛋白质相当或更大时，这些挑战更加突出。在许多生物应用中，聚合物回转半径（R_g）大于蛋白质半径R，该区域（R_g/R>1）即所谓蛋白质极限。理论与模拟表明，此情形下的行为与经典胶体极限（蛋白质远大于聚合物）显著不同。在蛋白质极限下，蛋白质周围的耗尽区体积可能超过蛋白质自身体积，从而有效浓缩聚合物溶液；同时，蛋白质自身也作为聚合物的拥挤剂，减小聚合物尺寸。尽管该区域具有生物学相关性，但实验探索甚少。迄今大多数实验研究的是胶体极限，少数蛋白质-聚合物或纳米颗粒-聚合物混合物研究达到了R_g>R，普遍观察到更大聚合物产生更强、更长程的吸引作用。在此，研究人员通过结合理论建模与大规模高通量实验映射蛋白质-聚合物混合物来填补这一空白。研究人员提出一个定量模型，能够在宽尺度范围内捕捉耗散驱动的相分离，同时显式考虑带电蛋白质之间的静电双电层排斥。为检验模型，研究人员利用高通量平台对牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）与聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）混合物进行系统实验，该平台每秒可生成50–150个样品。荧光显微镜和自动化图像分析产生了数万个独立数据点，从而可直接定量比较理论与实验。通过将模型与大尺度多维实验数据整合，研究人员提供了耗散效应与静电效应的并排综合评价。该方法为预测和理解拥挤环境中的蛋白质聚集建立了一个通用框架。

**蛋白质在拥挤环境中的自组装：自由体积理论与高通量微流体实验的定量统一**

**1. 研究背景与问题**

蛋白质等生物大分子在细胞环境中普遍存在，其通过液-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）实现细胞区室化是当前生物学研究的热点。同时，蛋白质错误折叠疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）与异常蛋白质自组装形成淀粉样纤维密切相关，而生物制剂（2022年新批准药物中占40.5%）的稳定储存也依赖于对蛋白质相行为的精确控制。在众多驱动相分离的机制中，由非吸附性聚合物（拥挤剂）排空产生的耗散相互作用（depletion interaction）是拥挤环境中蛋白质自组装的关键熵驱动力。经典Asakura–Oosawa–Vrij理论描述了胶体极限（聚合物远小于蛋白质）下的耗散作用，但实际生物体系中常出现蛋白质极限（R_g/R>1），此时聚合物尺寸与蛋白质相当或更大，多体耗散效应显著，传统对势近似失效。此外，静电排斥与耗散吸引之间的竞争对相稳定性至关重要，但现有理论难以同时定量描述这两类作用。因此，发展能够统一预测带电蛋白质-聚合物混合物相行为的理论框架，并利用大规模实验数据验证，是当前研究的迫切需求。

**2. 研究目标与主要技术方法**

针对上述挑战，研究人员提出一种结合自由体积理论（Free Volume Theory, FVT）和Barker–Henderson微扰理论的均场理论模型，用于描述带电蛋白质与非吸附聚合物混合物的相平衡。模型将蛋白质视为有效硬球，其有效直径通过静电排斥势的微扰计算获得；聚合物通过自由体积分数α和储层 osmotic pressure 贡献多体耗散吸引。实验上，研究人员利用组合液滴微流控平台（每分钟可生成50–150个液滴样品）系统扫描牛血清白蛋白（BSA）与不同分子量聚乙二醇（PEG）的相图，结合荧光显微成像和自动图像分析，每个条件获得超过10⁴个数据点。辅助技术包括小角X射线散射（SAXS）测定第二维里系数、共聚焦显微镜和荧光恢复后光漂白（FRAP）验证液滴的液态性质。BSA和PEG购自Sigma Aldrich，所有溶液均在100 mM磷酸钾缓冲液中配制，pH通过HCl或NaOH调节。数据集涵盖不同PEG分子量（2–20 kg/mol）、不同pH（4–8）和不同KCl浓度条件。

**3. 研究结果**

**3.1 理论与实验的相图比较**
在pH 7、100 mM磷酸盐缓冲液（离子强度I=0.207 M）条件下，微流控实验获得BSA-PEG6000体系的相图。通过拟合三个实验相界点，得到有效电荷Z=?24±1.3，由此计算的理论双节线与实验相边界定量吻合。FRAP实验测得液滴内分子迁移率为68±2%，特征恢复时间11±1 s，证实了液-液相分离的液态性质。该结果证明了模型在近生理条件下的预测能力。

**3.2 BSA-PEG分散体系中BSA的第二维里系数**
利用SAXS测量不同PEG浓度下BSA的前向散射强度，通过Debye图提取第二维里系数B2。实验与理论均显示随着PEG浓度增加，B2从无PEG时的正值（静电排斥主导）逐渐降低至负值（吸引主导），表明耗散作用增强。但定量上存在偏差，实验值在50 mg/mL PEG时接近B2=0（Boyle点），而理论预测在无PEG时B2/v>4（高于硬球值），该偏差可能源于SAXS方法对水化效应和相关项的敏感性。拟合得到的m=0.73±0.31与理论m=1.33不一致，提示需更多实验以无自由参数化预测。

**3.3 BSA-PEG分散体系的相稳定性分析**
在200 mM KCl、pH 7条件下，系统扫描PEG分子量2000至20000。实验发现，PEG 2000在扫描浓度范围内不引发相分离，而PEG分子量增大（10000、20000）时相分离在更低PEG浓度发生，符合较大聚合物产生更强耗散吸引的预期。理论模型使用单一拟合有效电荷Z=?41±2.9，半定量捕捉了双节线随PEG尺寸增大的移动趋势。但在稀BSA相区域，理论预测与实验偏差随PEG增大而增加，研究人员归因于长链PEG在稀蛋白环境中构象受限、有效尺寸减小，这一效应未纳入当前理论。

**3.4 pH对BSA-PEG分散体系相稳定性的影响**
在固定PEG6000和0.1 M缓冲液条件下，研究pH从4到8的相行为。实验显示，pH接近BSA等电点（pI≈4.7–5.6）时，静电排斥减弱，相分离在较低PEG浓度发生；pH升高至8时，蛋白质负电荷增加，需更高PEG浓度才能诱导相分离。理论模型通过调节有效电荷Z（从+16至?35）定量再现了pH 6、7、8下的相边界，但在pH 4和5（接近等电点）时定量吻合较差。研究人员指出，接近等电点时短程各向异性相互作用（如疏水或补丁吸引）和电荷调控效应未被当前模型捕捉，导致偏差。

**4. 讨论与结论总结**

讨论部分强调，模型在远离等电点、高电荷和中等离子强度条件下（如生理环境）具有良好预测能力；接近等电点时，各向异性吸引和电荷调节成为主导，需引入额外参数才能改善但会降低模型简洁性。静电部分采用Debye–Hückel近似和理想离子活度假设，导致高盐条件下拟合电荷偏高（如Z=?41），该值应理解为模型依赖的有效参数而非真实蛋白质净电荷；磷酸盐缓冲液中的特异性离子效应也可能影响蛋白质稳定性。尽管存在这些局限，模型在宽参数空间内成功捕捉了关键物理趋势，提供了简单高效的相稳定性预测工具。研究结论指出，结合自由体积理论与Barker–Henderson微扰理论的均场模型，能够定量预测带电蛋白质-聚合物混合物的相行为，并准确再现PEG分子量和pH对相边界的调控趋势；模型特别适用于蛋白质形状各向异性和特异性相互作用不主导的体系，如生理条件下的高电荷、中等离子强度环境。该框架为拥挤环境中蛋白质自组装的预测性控制奠定了理论基础，对生物医药和食品工业具有重要应用价值。