《Journal of Food Composition and Analysis》：Glucosinolate profiles of authenticated
Brassica vegetables, pungent plant species, and commercial dietary supplements: Implications for food composition and product authenticity
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中文摘要翻译
硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GSLs）是富含于芸苔属（Brassica）蔬菜及辛辣植物物种中的具有生物活性的含硫植物化学物质，然而有限的食物组成数据持续阻碍着商业膳食补充剂的质量评估与标准化进程。本研究采用一种经验证的超高效液相色
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硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GSLs）是富含于芸苔属（Brassica）蔬菜及辛辣植物物种中的具有生物活性的含硫植物化学物质，然而有限的食物组成数据持续阻碍着商业膳食补充剂的质量评估与标准化进程。本研究采用一种经验证的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QToF-MS）方法，对代表芸苔属蔬菜及辛辣物种的44种经认证植物材料以及69种膳食补充剂中的15种脱硫硫代葡萄糖苷（desulfoglucosinolates，ds-GSLs）进行了定量分析。该方法展现出优异的线性（R2 > 0.998）、灵敏度及精密度。经认证的植物材料呈现出显著的组别特异性谱型特征。羽衣甘蓝、西兰花、花椰菜及抱子甘蓝含有较高水平的吲哚族硫代葡萄糖苷（indole GSLs，包括 glucobrassicin、neo-glucobrassicin），同时含有 glucoraphanin 和 glucoiberin；而芜菁、辣根、山葵及西洋菜则以高水平的 sinigrin、gluconasturtiin 及总脂肪族硫代葡萄糖苷（aliphatic GSLs）为特征。与此同时，商业补充剂表现出显著的组成变异性，以相同植物成分名义销售的产品在总硫代葡萄糖苷含量及个体谱型上存在显著差异。部分补充剂的谱型与其声称的植物来源不一致，提示原料、加工或标签标注方面存在变异性。探索性化学计量学分析揭示了经认证材料中与组别相关的模式，并凸显了商业产品的组成异质性。这些结果提供了全面的硫代葡萄糖苷组成数据，并证明当前许多补充剂并不能可靠地反映真实的硫代葡萄糖苷谱型，凸显了产品标准化、真实性评估及膳食摄入量评估所面临的挑战。
论文解读
一、研究背景与问题提出
硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，GSLs）是一类来源于氨基酸的多样化含硫次生代谢产物，是十字花目（Brassicales）植物的特征性化学成分。该目包含具有重要经济意义的芸苔属（Brassica）植物，如羽衣甘蓝、西兰花、花椰菜、卷心菜、抱子甘蓝和芜菁等广泛消费的蔬菜，以及芥菜、辣根、山葵和西洋菜等辛辣植物物种。在植物中，GSLs 作为抵御食草动物和病原体的化学防御物质而存在。当组织因咀嚼、加工或其他物理损伤而破损时，GSLs 被内源性黑芥子酶（myrosinase）水解，产生异硫氰酸酯（isothiocyanates，ITCs）、腈类及相关降解产物等一系列生物活性化合物。这些水解产物不仅赋予了芸苔属蔬菜特有的辛辣风味，还与多种促进健康的作用相关，包括癌症化学预防、抗炎活性、葡萄糖和脂质代谢调节以及抗氧化、抗菌和抗真菌特性。
尽管 GSLs 具有重要的生物学意义和健康促进潜力，但当前研究面临若干关键问题。首先，GSLs 的结构多样性、广泛的极性范围以及在提取和样品制备过程中易于降解的特性，使得其准确表征在分析上具有挑战性。其次，尽管以芸苔属植物为来源的膳食补充剂作为 GSLs 及其生物活性水解产物的浓缩来源日益受到市场青睐，但关于市售膳食补充剂中 GSLs 组成的信息相对匮乏。现有研究多集中于新鲜植物材料，而收获、加工、提取、制剂及储存对成品中 GSLs 组成的影响尚未得到充分表征。第三，正如 Wu 和 Pehrsson 所指出的，由于组成信息不足，美国目前尚无法获得 GSLs 膳食摄入量的估计值。这一局限性在膳食补充剂市场快速扩张以及对芸苔属来源生物活性化合物兴趣日益增长的背景下尤为突出。
因此，本研究的目的是：（i）开发并验证一种能够进行定量 GSLs 谱型分析并具有结构确认能力的互补性 UHPLC-QToF-MS 方法，并将其应用于大量经认证植物材料和商业补充剂；（ii）建立经植物学验证的植物材料的 GSLs 组成谱型；（iii）评估市售膳食补充剂之间的组成变异性；（iv）评估补充剂 GSLs 谱型与其声称的植物来源材料之间的关系。研究共分析了44种经植物学验证的植物样品和69种商业膳食补充剂，并采用探索性化学计量学分析来考察组成模式并区分不同植物学组别。
二、主要关键技术方法
研究人员开发并验证了一种基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QToF-MS）的定量分析方法，用于同时定量15种脱硫硫代葡萄糖苷（ds-GSLs）。该方法采用 Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱（2.1 × 150 mm，1.8 μm）在40 °C下进行分离，流动相为含0.1%甲酸的水和乙腈体系，梯度洗脱。质谱分析采用电喷雾离子源（ESI），在正负离子模式下采集，定量分析在正离子模式下进行，以 glucotropaeolin（GTL）作为内标。方法按照 ICH 指南进行了线性、灵敏度、精密度、重复性和准确性的全面验证。此外，研究人员还采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UHPLC-DAD）对代表性植物材料进行了对比分析，以评估两种平台之间的定量一致性。化学计量学分析采用 MetaboAnalyst 6.0 软件，包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。样本来源方面，44种经认证植物材料包括羽衣甘蓝（n = 6）、西兰花（n = 9）、花椰菜（n = 10）、抱子甘蓝（n = 8）、芜菁（n = 5）、山葵（n = 3）、西洋菜（n = 2）和辣根（n = 1），其中山葵样品来自密西西比大学国家天然产物研究中心（NCNPR）的收藏，其余植物材料购自当地零售市场并由 NCNPR 的专家进行了植物学认证；69种商业膳食补充剂则从服务美国市场的国内外供应商处获得。
三、研究结果
3.1 UHPLC-QToF-MS 方法性能
研究人员优化了色谱分离条件，在40 °C柱温下使用 Eclipse Plus C18 色谱柱实现了15种 ds-GSLs 的基线分离，峰形对称。高分辨率 QToF-MS/MS 分析产生了特征性碎裂模式，通过硫酸盐和葡萄糖基团的连续丢失生成了与侧链相关的诊断性产物离子，从而能够对所有目标 GSLs 进行可靠的结构确认。方法验证结果表明，所有分析物的校准曲线相关系数（R2）在0.9975至0.9998之间，检测限（LOD）为0.10至3.18 μg/mL，定量限（LOQ）为0.20至6.37 μg/mL，日内和日间精密度（RSD%）分别在0.02%至3.91%和0.32%至2.67%范围内，加标回收率为88.81%至106.21%。与 UHPLC-DAD 的对比分析显示两种方法具有良好的定量一致性。
3.2 经认证植物材料的硫代葡萄糖苷组成
研究人员将验证后的方法应用于44种经认证植物材料的 GSLs 组成分析。结果表明，不同植物学组别之间存在显著的 GSLs 含量和谱型差异。羽衣甘蓝以吲哚族 GSLs 为主，特别是羟基硫代葡萄糖苷（HGBS）为主要成分，含量范围为6.06至345.16 mg/100 g干重。西兰花以 glucoraphanin（GRA）为主导，含量范围为72.02至354.26 mg/100 g，同时含有可观的吲哚族 GSLs。花椰菜表现出相对均衡的组成，同时含有中等水平的脂肪族和吲哚族 GSLs。抱子甘蓝在所检芸苔属蔬菜中总 GSLs 含量最高，特别富含 HGBS 和 glucobrassicin（GBS），HGBS 含量最高达625.97 mg/100 g。值得注意的是，芜菁的 GSLs 谱型更接近于辛辣植物物种而非叶用芸苔属蔬菜。西洋菜含有异常高浓度的 gluconasturtiin（GST）、HGBS 及芳香族 GSB 和 GBB。辣根和山葵则以 sinigrin（SIN）为主导，含量分别为309.92 mg/100 g 和699.10至752.68 mg/100 g。芜菁以 HGBS、GST 和 progoitrin（PRO）为主要成分，HGBS 最高达1244.97 mg/100 g。
3.3 商业膳食补充剂的硫代葡萄糖苷组成
研究人员对69种商业膳食补充剂进行了分析，涵盖标注为西兰花（n = 23）、羽衣甘蓝（n = 15）、花椰菜（n = 7）、抱子甘蓝（n = 1）、西洋菜（n = 7）、芜菁（n = 2）、辣根（n = 7）和山葵（n = 7）的产品。商业补充剂在总 GSLs 含量和个体组成上均表现出显著变异性，总 GSLs 浓度范围从不足2 mg/100 g到超过12,900 mg/100 g。西兰花补充剂的总 GSLs 含量变异性最大，从微量到超过12,000 mg/100 g不等。羽衣甘蓝补充剂的总 GSLs 含量普遍低于西兰花产品。花椰菜补充剂的谱型相对简单，以 GRA、HGBS、GBS 和 GIB 为主。西洋菜补充剂的 GSLs 含量普遍较低（约2至38 mg/100 g），而辣根补充剂含量较高（904至1354 mg/100 g），SIN 为主要成分。山葵补充剂变异性显著，总 GSLs 含量从1.3至1664 mg/100 g不等。芜菁补充剂含量中等（4.9至86.9 mg/100 g），以 HGBS、GST 和 PRO 为特征。
3.4 经认证植物材料与商业膳食补充剂的比较
研究人员将经认证植物材料中测得的 GSLs 浓度范围与商业产品中检测到的浓度进行了系统比较。西兰花产品中，经认证样品始终以高浓度 GRA（72.02至354.26 mg/100 g）为特征，而商业产品的 GRA 含量从0.19至2725.35 mg/100 g不等，部分标注为西兰花提取物或西兰花种子提取物的产品中 GRA 含量远超经认证西兰花，提示使用了浓缩提取物或富集成分；另一些产品尽管标注为西兰花来源，却仅含微量 GRA 和总 GSLs。羽衣甘蓝产品同样表现出更宽的浓度范围，部分标注为羽衣甘蓝叶提取物的产品仅含微量特征性吲哚族 GSLs。西洋菜和芜菁产品的差异最为显著：经认证西洋菜的总 GSLs 含量超过1200 mg/100 g，而商业产品仅为1.96至37.32 mg/100 g，且基本缺乏特征性芳香族和吲哚族 GSLs；经认证芜菁的总 GSLs 含量超过1000 mg/100 g，而补充剂仅为4.89至86.93 mg/100 g。辣根产品是经认证材料与商业产品最为接近的类别，两者均以 SIN 为主导。部分山葵补充剂保留了经认证山葵中 SIN 和 GST 丰富的特征谱型，但产品间变异性显著。
3.5 硫代葡萄糖苷谱型的化学计量学分析
研究人员将样本分为两组：A组为叶用芸苔属蔬菜（羽衣甘蓝、西兰花、花椰菜和抱子甘蓝），B组为辛辣植物物种和芜菁（西洋菜、辣根、山葵和芜菁）。初步 PCA 显示两组之间存在自然聚类趋势，前两个主成分解释了约49%的总方差。PLS-DA 模型采用三个潜变量，获得 R2Y 为0.775，交叉验证 Q2 为0.753，交叉验证分类准确率为92.3%，置换检验（1000次）表明模型性能显著优于随机分类（经验 p < 0.001）。载荷向量分析表明，脂肪族 GSLs（特别是 SIN、GRA 和 GNA）以及总脂肪族 GSLs 是与辛辣植物物种和芜菁分离相关的主要变量，而吲哚族 GSLs（包括 GBS、HGBS、neo-GBS）和总吲哚族 GSLs 则与叶用芸苔属蔬菜更密切相关。在物种特异性 PLS-DA 分析中，山葵形成独立聚类，以高 SIN 浓度和高 SIN/GRA 比率为特征。
3.6 使用硫代葡萄糖苷谱型评估产品真实性
研究人员发现 SIN/GRA 比率是评估产品真实性的有用指标，因为这两种化合物在分析的植物学组别中呈现对比性分布。经认证植物材料在各组内表现出相对一致的 SIN/GRA 比率：西兰花因高 GRA 含量而呈现低比率，山葵因 SIN 占主导而呈现显著升高的比率，羽衣甘蓝和花椰菜则呈现中间比率。相比之下，商业补充剂的 SIN/GRA 比率变异性显著增大。部分西兰花补充剂（BP15 和 BP17）表现出相对于经认证西兰花异常高的 SIN/GRA 比率。商业山葵补充剂的平均 SIN/GRA 比率（约1075.7）显著高于经认证山葵（约703.0），这种升高的比率与含有天然富含 SIN 的成分（如辣根或芥菜）一致，这些成分此前曾被报道为商业山葵产品中的替代品或掺假物。
四、讨论总结与研究结论
研究讨论部分指出，可靠估计膳食 GSLs 摄入量需要全面且经分析验证的食物和膳食补充剂组成数据。然而，目前美国尚无全国性的 GSLs 摄入量估计值，主要原因是标准化的组成数据有限。商业补充剂中观察到的显著组成变异性对基于标签声明预测 GSLs 暴露量构成了挑战，凸显了在建立食物组成数据库和估算膳食 GSLs 摄入量时进行分析验证的重要性。研究人员强调，个别 GSLs 浓度升高可能源于植物部位差异、原料组成、提取和浓缩程序、加工、选择性富集或制剂等因素，因此异常高的 GSLs 水平本身不应被解释为植物替代、掺假或意外植物学身份的证据。区分有意富集与植物学组成差异需要额外的背景信息，必要时还需采用正交验证方法。
研究结论表明，经认证的植物材料呈现出高度特征性的 GSLs 指纹图谱，为评估商业膳食补充剂产品的 GSLs 谱型、真实性和标准化提供了有价值的组成基准。商业膳食补充剂经常表现出与经认证来源材料显著不同的 GSLs 组成：在某些情况下，观察到的浓度远超经认证植物中的浓度，与使用浓缩提取物或富集制剂一致；而其他产品仅含微量的预期 GSLs。这些发现强调了仅凭补充剂标签声明预测 GSLs 暴露量的困难，并凸显了在开发食物组成数据库和估算膳食 GSLs 摄入量时进行分析验证的重要性。该研究为将经认证植物材料与含 GSLs 的商业补充剂联系起来的定量组成数据集提供了基础，建立了可用于评估市售产品组成变异性和产品一致性的参考谱型。该论文发表于《Journal of Food Composition and Analysis》。
