基于多组学与酶学表征的哈氏肠杆菌ES1降解烟嘧磺隆过程中关键基因Eh-fadB的功能鉴定

《Journal of Hazardous Materials》：Functional Identification of the Key Gene Eh-fadB in Nicosulfuron Degradation by Enterobacter hormaechei ES1 Based on Multi-Omics and Enzymatic Characterization

　　

**摘要**

烟嘧磺隆是一种磺酰脲类除草剂，其残留物对农业土壤构成生态风险。本研究通过全基因组测序、转录组学、代谢组学、基因敲除、异源表达和土壤生物修复试验，阐明了哈蒙肠杆菌ES1的降解机制。在烟嘧磺隆胁迫下，ES1上调了包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）在内的抗氧化酶，以及谷胱甘肽合成，以清除过量的活性氧（ROS）。高效液相色谱-飞行时间质谱（HPLC-TOF-MS）鉴定了2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶（ADMP）和2-氨基磺酰-N,N-二甲基烟酰胺（ASDM）等降解中间产物，表明磺酰脲桥被初步裂解。整合多组学分析将编码脂肪酸β-氧化多功能酶的Eh-fadB确定为一种新型降解基因。Eh-fadB的定向敲除使烟嘧磺隆降解率从87.6%降至37.04%，而基因互补使活性几乎完全恢复。纯化的Eh-FadB可直接转化烟嘧磺隆，在30°C和pH 5-6时表现最优；其活性被Na?和Pb2?增强，但被Fe3?抑制。分子对接和分子动力学分析鉴定His-450和Asn-427为底物结合的关键残基。在受污染土壤中，接种ES1在21天内降低了烟嘧磺隆含量，并促进了脱氢酶和脲酶活性的恢复。本研究首次提供了FadB型酶参与烟嘧磺隆降解代谢的遗传学和生物化学证据，支持磺酰脲桥裂解，并为其土壤生物修复的应用潜力提供了依据。

**引言**

烟嘧磺隆是一种磺酰脲类除草剂，主要用于控制玉米田中的禾本科杂草和阔叶杂草[1]。由于其高效性和强选择性，烟嘧磺隆已成为玉米生产中的主要除草剂之一[2]。其分子结构稳定，在中性或碱性条件下降解缓慢，半衰期可达190–250天[3]。残留的烟嘧磺隆不仅污染土壤，还可能通过淋溶和渗透到达地下水。在中国东北地区，土壤中烟嘧磺隆的浓度高达560.44 μg/kg，是最常检测到的除草剂之一[4]。在美国，烟嘧磺隆等磺酰脲类除草剂的残留物已在饮用水、地表水和地下水中被检测到，浓度范围为2.1至80.4 ng/L，超过了国家和国际标准规定的允许限值[5]。烟嘧磺隆残留物还威胁着后茬作物的生长。例如，仅0.3 μg/kg的土壤烟嘧磺隆残留浓度就能抑制甜菜（玉米后的典型后茬作物）的生长[6]。此外，烟嘧磺隆残留物还会对土壤生态产生不利影响：长期暴露改变了土壤微生物群落结构，损害了土壤酶活性，抑制了土壤无脊椎动物的生长和活性，最终导致土壤肥力下降[7]。目前，烟嘧磺隆等磺酰脲类除草剂污染的修复已成为确保作物安全和减轻生态风险的关键问题。

物理和化学修复技术在成本、二次污染和选择性方面仍存在局限性[8]。相比之下，微生物修复被认为是一种高效、环保且低成本的技术[9]。具有修复能力的微生物主要包括真菌、放线菌和细菌[10]。其中，细菌因其高降解效率、广谱底物适应性和快速增殖等优势而被广泛报道。例如，枯草芽孢杆菌YB1可以在5天内降解初始浓度为2 mg/L的烟嘧磺隆的87.9%；此外，该菌株还能降解多种磺酰脲类除草剂，包括苯磺隆、甲磺乙基和乙草磺隆[11]。然而，许多降解烟嘧磺隆细菌的研究仅限于其降解性能，而相应的降解基因、酶和途径仍有待阐明。因此，阐明分子降解机制尤为重要。因此，整合多组学、生物化学试验和分子生物学技术，系统地破译微生物菌株的降解机制并评估其对土壤除草剂污染的修复效果具有重要的实践意义。

在农药污染日益加剧的背景下，环境胁迫耐受性和维持胞内氧化还原稳态的能力是影响微生物农药降解的重要生理因素。例如，据报道，烟嘧磺隆诱导的ROS抑制了短杆菌属DNS10中trzN的转录，伴随烟嘧磺隆降解效率从76.0%降至42.6%[12]，表明氧化胁迫可以以菌株和基因依赖的方式影响农药降解过程。除了这些生理响应外，鉴定和表征直接参与外源物转化的基因和酶对于阐明微生物降解机制至关重要。例如，在里氏菌ES2中删除降解基因El-rutA导致烟嘧磺隆降解效率显著降低[13]。水解酶和氧化还原酶是参与微生物除草剂降解的主要酶类。例如，荧光假单胞菌B2的儿茶酚2,3-双加氧酶催化儿茶酚的间位裂解生成2-羟基粘康酸半缩醛，而CYP450单加氧酶催化乙草磺隆降解中的初始氧化步骤[14]。研究除草剂的降解产物和途径有助于解释降解酶和降解机制的多样性。2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶（ADMP）和2-氨基磺酰-N,N-二甲基烟酰胺（ASDM）都是烟嘧磺隆降解过程中最关键的产物，由磺酰脲桥的C–N键裂解产生，这代表了烟嘧磺隆的主要降解途径之一[15]。此外，近年来还发现了其他降解途径。例如，据报道，吉林克雷伯氏菌2N3也可以通过C–S键的异裂降解烟嘧磺隆[16]。烟嘧磺隆的降解产物最终可以通过中心碳代谢（例如三羧酸循环和糖酵解）进入细菌的不同代谢循环，或通过氨基酸生物合成途径，这一过程也与细菌物种密切相关[17]。总之，阐明不同微生物菌株降解烟嘧磺隆过程中涉及的中间产物、终产物和代谢途径是必要的。

组学技术是探索除草剂降解机制的重要工具。基因组学提供了细菌的完整遗传背景，而转录组学和代谢组学可以揭示除草剂胁迫下的差异表达基因（DEGs）和差异代谢物。通过整合分析，可以快速鉴定潜在的功能基因和代谢途径[18]。例如，多组学分析被应用于筛选bssS和atzF等基因，并验证了它们在变形杆菌NS8烟嘧磺隆代谢途径中的关键作用[19]。此外，可以通过液相色谱-质谱（LC–MS）分析推断特定的降解产物[20]。此外，可以使用基于同源重组的基因敲除和原核表达等技术验证基因和蛋白功能。Hang等通过自杀质粒pJQ200SK（通过同源重组）的插入突变成功敲除了汉斯施莱赫利亚菌S113中的sulE（编码磺酰脲酯酶），并发现sulE敲除突变体ΔsulE完全丧失了脱酯降解能力[21]。最终，必须在实际土壤环境中验证除草剂降解微生物的修复功能。总之，鉴于微生物的多样性和其代谢活动的复杂性，整合多组学与其他方法来全面分析降解细菌的生物学特征和降解的分子机制，并阐明其在土壤中的修复效果，是评估降解细菌应用潜力的可靠策略。

先前的研究表明，哈蒙肠杆菌ES1（保藏号：CCTCC M 20232422）在35°C、pH 6.0、4%接种量、烟嘧磺隆初始浓度为20 mg/L的条件下，在96小时内达到了93.09%的降解率[22]；然而，该菌株的分子降解机制尚未得到充分阐明。尽管越来越多的烟嘧磺隆降解细菌已被分离和表征，但当前的研究主要局限于菌株筛选和基本的降解性能分析，缺乏对胞内胁迫响应、关键功能降解基因和潜在分子机制的系统剖析。值得注意的是，参与脂肪酸降解途径的酶在磺酰脲类除草剂分解代谢中的作用尚未见报道，降解菌株的现场生物修复效率及其对土壤生态功能的影响也尚未得到系统评估。为弥补这些关键知识空白，本研究通过整合多组学分析、生物化学试验和分子生物学技术，系统地研究了ES1菌株的烟嘧磺隆降解机制和应用潜力，目标如下：(1) 通过全基因组分析表征ES1菌株的遗传背景和潜在功能基因；(2) 检验ES1在烟嘧磺隆诱导胁迫下的细胞响应机制；(3) 通过高效液相色谱-飞行时间质谱（HPLC-TOF-MS）鉴定烟嘧磺隆降解产物并探索降解途径；(4) 通过整合转录组学和代谢组学分析筛选差异表达基因和差异代谢物；(5) 使用基因敲除、异源表达和分子对接阐明关键功能基因Eh-fadB在烟嘧磺隆降解中的分子机制；以及(6) 评估ES1菌株在受污染土壤中的生物修复效果及其对土壤酶活性的影响。本研究首次鉴定出FadB作为一种新型烟嘧磺隆生物降解效应酶，从基因和酶到代谢物和土壤生态功能的多层次系统解释了降解过程。总之，我们的发现不仅加深了对细菌降解磺酰脲类除草剂的机制理解，还为发展受除草剂污染土壤的微生物修复技术奠定了坚实的理论基础，并提供了一种有前景的微生物资源。

**各部分片段**

**细菌菌株、培养基和试剂**

ES1菌株由吉林农业大学生命科学院农药科学系分离并提供。烟嘧磺隆（分析纯标准品）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司（中国上海），溶于乙腈配制储备液（5000 mg/L），经0.22 μm有机滤膜过滤，室温避光保存。本研究使用的培养基制备方案列于补充材料中。

**ES1菌株的全基因组分析**

全基因组测序显示，ES1菌株的基因组长度为4,778,474 bp，基因组注释预测了4,515个编码序列（CDS），占总基因组长度的88.23%，以及25个rRNA基因、83个tRNA基因和79个假基因（图1A）。共有2,461个基因在GO术语中被注释（图1B）。在GO术语的生物学过程类别中，基因最富集于"细胞过程"和"代谢过程"，表明ES1拥有遗传背景……

**结论**

本研究系统地阐明了哈蒙肠杆菌ES1降解烟嘧磺隆的分子机制，并评估了其土壤生物修复潜力。基因组和多组学分析表明，ES1对烟嘧磺隆暴露具有协调的代谢和氧化胁迫响应，并鉴定出Eh-fadB作为一个关键降解基因。Eh-fadB的敲除使烟嘧磺隆降解率从87.6%降至37.04%，而生物化学……

**环境意义**

烟嘧磺隆的广泛和长期应用导致其在农业土壤中持续积累，对后茬作物和生态系统功能构成重大风险。微生物修复提供了一种环保且经济的解决方案，但高效细菌降解的分子机制在很大程度上仍未得到探索。在本研究中，我们系统地破译了哈蒙肠杆菌降解烟嘧磺隆的完整分子框架……

**未引用参考文献** [23]; [68]; [73]

**作者贡献声明**

刘阔：验证、软件、资源、方法、调查、形式分析。吴玉林：验证、软件、资源、方法、调查。吴仙：撰写—审阅与编辑、撰写—原稿、可视化、验证、软件、资源、方法、调查、形式分析、数据管理、概念化。李祖仁：撰写—审阅与编辑、撰写—原稿、可视化。张浩：调查、形式分析。白连阳：监督、

**利益冲突声明**

作者声明不存在已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

**致谢**

本研究获得湖南省自然科学基金（2024JJ1005）资助。

吴仙 | 刘阔 | 吴玉林 | 丁玉波 | 肖玉凤 | 张浩 | 白连阳 | 李祖仁
湖南大学生物学院隆平分院，长沙410125，中国