猪源大肠杆菌基因组图谱用于识别抗生素耐药性、致病性和传播潜力：对环境和公共卫生的影响

《Journal of Infection and Public Health》：Genomic landscape of Escherichia coli from swine to identify antibiotic resistance, pathogenicity, and dissemination potential: Implications for environmental and public health

　　

背景：抗菌药物耐药性大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）在牲畜（尤其是猪）中的出现，对动物、环境和公共卫生构成日益严重的关注。不规范的养猪生产系统可能成为具有人畜共患潜力的多重耐药菌株的储存库。方法：本研究使用抗菌药物敏感性试验和PCR筛选ESBL/AmpC基因（bla_CTX-M、bla_TEM、bla_SHV、bla_AmpC），分析了来自印度卡纳塔克邦猪的大肠杆菌分离株。10株阳性分离株使用Illumina MiSeq平台进行全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS），生物信息学分析包括鉴定抗菌药物耐药基因（antimicrobial resistance genes, ARGs）、毒力因子（virulence factors, VFs）、移动遗传元件（mobile genetic elements, MGEs）、质粒复制子和生物膜相关基因。分子分型（多位点序列分型MLST、血清分型、CH分型、Clermont系统发育分群）以及与53个全球猪源大肠杆菌基因组的比较系统发育分析。结果：多重PCR确认25/29个分离株为大肠杆菌，PCR在10个大肠杆菌分离株中鉴定出ESBL和/或AmpC基因（3株仅含单一ESBL基因，4株含多个ESBL基因，1株ESBL+AmpC共存，2株仅携带AmpC）。WGS揭示48个独特的ARGs，其中bla_TEM-1B和sul1最为普遍，ESBL（bla_CTX-M）和AmpC（bla_CMY）基因分别在2个和3个分离株中被鉴定。整合子-整合酶基因（intI₁/intI₂）与2个分离株中的dfrA₁₇相关，表明MGEs参与耐药基因携带，毒力组分析鉴定出34个保守毒力基因。高度遗传多样性包括9种序列型、多个系统发育群（A、B1、C、F、G）、7种血清型组合，CH分型揭示了如fimH₅₈和fumC₄等等位基因。高Simpson多样性指数（MLST为0.978；血清型为0.952）证实了这种异质性。比较系统发育基因组学表明印度分离株（如ST624、ST117）与全球谱系聚类。结论：猪源大肠杆菌中多种耐药决定簇、VFs和MGEs的共存突显了其基因组多样性。这些发现强调需要在“同一个健康”（One Health）框架内进行综合基因组监测和抗菌药物管理。

论文解读

一、研究背景与研究目的

大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）是一种适应性极强的细菌，既可作为胃肠道共生菌存在，也可作为机会致病菌感染人类和动物。在猪等家畜中，致病性E. coli菌株不仅造成重大经济损失，还被认为是潜在的人畜共患病原体，对公共卫生构成威胁。近年来，抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）E. coli，尤其是多重耐药（multidrug-resistant, MDR）菌株的流行日益严重，其中产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase, ESBL）和AmpC β-内酰胺酶的菌株尤为令人担忧，因为这些酶可水解包括第三代头孢菌素在内的β-内酰胺类抗生素，限制治疗选择。耐药性状通常由移动遗传元件（mobile genetic elements, MGEs），如质粒、整合子（携带intI₁基因的1类整合子）和转座子介导，这些元件可促进耐药基因在不同细菌物种间的水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT）。在印度，集约化畜牧业与抗生素的不规范使用加速了MDR E. coli的出现和传播，但猪源菌株在国家基因组AMR监测中代表性不足。因此，本研究旨在利用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）技术，对印度猪源E. coli进行基因组解析，鉴定其耐药基因、毒力因子、移动元件及传播潜能，为One Health框架下的综合监测和抗菌药物管理提供科学依据。该论文发表于《Journal of Infection and Public Health》。

二、主要关键技术方法

研究样本来自印度卡纳塔克邦Chikkaballapur地区，2019年1月至4月间从24户家庭的16个村庄采集25份猪新鲜粪便拭子。研究人员首先通过MacConkey和EMB培养基分离培养，结合IMViC生化试验和多重PCR（mPCR）靶向lacY、lacZ、cydA、uidA、phoA五个基因进行表型和基因型确认。利用K-B纸片扩散法进行17种抗生素的药物敏感性试验，并依据CLSI标准判定耐药表型。通过PCR检测bla_CTX-M、bla_TEM、bla_SHV和bla_AmpC基因，从中筛选10株ESBL/AmpC阳性菌株进行Illumina MiSeq平台WGS。采用SPAdes组装，Prokka注释，使用ResFinder、VirulenceFinder、PlasmidFinder、MobileElementFinder等工具分别鉴定ARGs、VFs、质粒复制子和MGEs，并利用MLST、SerotypeFinder、CHTyper、ClermontTyping进行分子分型，与全球53株猪源E. coli基因组进行核心基因组系统发育比较。

三、主要研究结果

1. E. coli分离株的表型和基因型确认

研究人员从25份样本中分离到29个非重复疑似菌落，经mPCR扩增确认25株为E. coli，其中uidA和phoA基因检测率最高，表明多基因组合可提高鉴定准确性，与印度先前研究一致。

2. 抗菌药物敏感性谱

药敏试验显示，分离株对β-内酰胺类药物耐药率较高，其中阿莫西林-克拉维酸耐药率为64%，氨苄西林为40%，头孢噻肟为44%；氟喹诺酮类中萘啶酸耐药率为60%，恩诺沙星为24%；四环素耐药率为40%。对最后一线药物如亚胺培南（92%敏感）和多粘菌素（88%敏感）保持较高的敏感性。

3. ESBL/AmpC基因检测

PCR结果显示，7株ESBL阳性菌株中bla_CTX-M检出率最高（6/7，85.71%），bla_CTX-M-15为主要变异型；bla_TEM检出4株，bla_SHV检出1株。AmpC阳性菌株均携带bla_CMY-2，其中一株同时携带bla_CTX-M-15和bla_CMY-2，表明ESBL与AmpC共现现象存在。

4. WGS检测ARGs

WGS在10株菌中共鉴定出48种独特ARGs，bla_TEM-1B和sul1存在于8株中，aph(6)-Id和qnrB4分别见于6株和5株。有7株菌携带针对≥3类抗生素的耐药基因，呈现MDR特征；两株菌各携带超过30个ARGs。Pearson相关分析显示ARGs与VFs数量呈正相关（r=0.72，p=0.031）。

5. 毒力谱分析

共检测到105个毒力基因，其中34个（如entA、entB、entF、csgF）在所有菌株中保守存在，涉及铁获取和生物膜形成。fyuA/irp1/irp2共现表明存在耶尔森菌高致病性岛，iro、iut/iuc等铁载体系统也广泛存在。一株菌携带senB基因，该基因通常与人源ExPEC菌株相关，提示潜在的人畜共患风险。

6. 生物膜形成基因分析

所有菌株均携带curli纤维合成基因（csgB、csgD、csgF、csgG）、外膜蛋白基因ompA及菌毛基因（fimF、fimG、fimH），提示其具备生物膜形成能力，有助于菌株在养殖环境及粪便中持续存在。

7. 质粒分型

最常检测到的质粒复制子为IncFIB(AP001918)（7株），其次为IncFIA（5株）和IncFIC(FII)（4株）。多种IncF复制子组合（如IncFIC+IncFIA、IncFIB(pHCM2)）提示存在复杂的嵌合质粒结构，可能促进耐药和毒力基因共同转移。

8. MGEs分析

鉴定出插入序列IS26、ISEc9（ISEcp1）、IS903等及单位转座子Tn2、Tn6082。特别地，ISEc9与bla_CTX-M基因在多个菌株中物理相邻，IS26常侧翼连接多个耐药基因。两个菌株携带携带intI₁和dfrA₁₇基因盒的完整1类整合子，为甲氧苄啶耐药提供了遗传基础，并可能捕获aadA、sul1等更多耐药基因。

9. MLST和系统发育多样性

MLST分型揭示10株菌分为9种序列型(ST)，Simpson多样性指数为0.978，呈多克隆结构。其中ST624出现两次，ST10、ST23、ST101、ST117等各出现一次。ST10、ST101、ST117、ST624均已被报道与猪和人类感染相关。

10. 血清型分析

共鉴定出7种O:H血清型组合，O1:H1出现两次，其余如O78:H9、O8:H17、O103:H40等各出现一次。Simpson指数为0.952，证实抗原高度异质性。O1、O8、O78等血清群具有致病意义，与ExPEC或猪肠道病相关。

11. CH分型基因

fimH等位基因以fimH₅₈为主（2株），fimH₅₄、fimH₄₀₂、fimH₈₆各在1株中出现；fumC等位基因以fumC₄最常见（4株），其次为fumC₁₁（3株）。fimH₅₈曾与具人畜共患潜力的ExPEC菌株相关。

12. Clermont系统发育分群

10株菌属于A、B1、C、F、G五个系统发育群，其中B1和A各3株，F群2株，C和G各1株。F群通常与ExPEC相关，提示这些猪源菌株可能具有人畜共患能力。

13. 系统发育分析

基于核心基因组SNP构建的系统发育树显示，本研究的印度分离株与来自欧洲和东南亚的ExPEC参考菌株聚类，其中ST624和ST117与全球谱系密切相关，提示存在共同的进化压力或全球传播。

四、讨论与结论

讨论部分指出，猪源E. coli呈现高度遗传可塑性，多种血清型、耐药决定簇、质粒和MGEs在遗传异质性菌株中汇聚，抗生素选择压力可能驱动了这种多样性，使多耐药且具潜在毒力的菌株得以持续存在。耐药基因与毒力基因（如fimH、astA）共存，以及与IncF质粒相关的耶尔森菌高致病性岛、沙门菌素、气杆菌素和肠毒素senB等ExPEC标志物的存在，提示猪源E. coli可能作为全球相关ExPEC谱系的储存库，跨动物、环境和人类界面传播耐药和毒力性状。研究同时存在局限性，如样本量小、富集培养可能引入偏差、仅选用单一菌落、WGS仅对10株进行，结果应视为探索性。

研究结论：本研究提供了猪源E. coli的全面基因组特征描述，揭示了多种ARGs、VFs和MGEs，确认了ISEc9（ISEcp1）和IS26在bla_CTX-M等关键耐药基因动员和传播中的作用，以及1类整合子整合酶基因（intI₁）介导dfrA等耐药基因盒的捕获和扩散。多个菌株（尤其ST624和ST117）与全球分布的ExPEC菌株亲缘关系密切，质粒复制子和MGEs共携带耐药与毒力基因，进一步强调了HGT在耐药传播中的重要作用。这些发现重申了开展整合监测以追踪这些MGEs的必要性，以减轻猪源耐药E. coli对动物、环境和人类健康的风险。