血红素与SpyTag/SpyCatcher系统之间的相互作用：迈向人工生物启发的金属蛋白

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Interaction between hemin and the SpyTag/SpyCatcher system: towards an artificial bioinspired metalloprotein

　　

摘要：人工金属酶（artificial metalloenzyme）的设计具有挑战性，可通过生物偶联（bioconjugation）策略实现，即在一个肽段上靶向插入合成的金属配位基序，随后该肽段可共价连接至蛋白质支架。Spy系统由蛋白结构域SpyCatcher组成，其可与短肽SpyTag自发反应，形成共价异肽键（isopeptide bond），可用于上述目的。在本工作中，研究人员设计了一种经组氨酸基结构域功能化的SpyTag肽，该肽既能以游离肽形式结合血红素（hemin），也能在与SpyCatcher组装后结合血红素。SpyTag与血红素之间的结合成功实现，亲和力达微摩尔级，但血红素与重组Spy蛋白（即SpyTag/SpyCatcher加合物）的配位未能维持同等强度。血红素-SpyTag肽复合物在过氧化氢活化的氧化反应中表现出增强的反应活性，而SpyTag/SpyCatcher加合物对血红素反应活性无显著影响。两种体系均未表现出明显的过氧化氢酶样（catalase-like）活性。所有受试组分均具有活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除作用，这可能是由于肽/蛋白骨架发生了氧化修饰。总体而言，该研究提供了坚实的实验与方法学基础，并强调了在Spy系统内改善血红素结合的必要性，以期为未来优化和开发更先进的人工血红素蛋白奠定基础。

论文解读：血红素与SpyTag/SpyCatcher系统的相互作用——迈向人工生物启发金属蛋白

一、研究背景与问题

人工金属酶（artificial metalloenzyme）是将金属辅因子与蛋白质支架相结合形成的杂合催化物种，其设计理念源自天然酶。自20世纪70年代以来，研究人员致力于开发这类生物分子，使非天然金属辅因子能够在蛋白质支架内的特定位置结合，从而将金属配合物的氧化还原或路易斯酸性质与蛋白质固有的底物和产物选择性相融合，创造出能够催化自然界中罕见或不存在但具有纳米与生物技术应用价值反应的生物催化剂。

为实现生物偶联，研究者可利用多种相互作用类型：天然氨基酸活性基团的反应、疏水/离子/氢键等非共价相互作用、涉及非天然氨基酸和肽标签的生物正交共价相互作用，以及二硫键、酯键、硫酯键和异肽键等共价交联。其中，原核生物来源的异肽键受到关注，因为多种细菌蛋白中的异肽键在蛋白质结构和功能中发挥重要作用。异肽键涉及残基侧链而非α-碳上的氨基和羧基，可显著增强三级结构中空间邻近但一级序列上相距较远的蛋白区域间的相互作用。

化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的纤连蛋白结合蛋白FbaB中的CnaB2结构域具有由九条β-链组成的β-三明治三级结构，其第1链的赖氨酸残基（Lys 31）与第9链的天冬氨酸残基（Asp 117）形成异肽键。Howarth及其同事对该结构进行了重新设计，将其理想化地拆分为蛋白质组分（第1至8链，命名为SpyCatcher，SC）和肽组分（对应第9链，命名为SpyTag，ST）。当两个组分独立表达或合成后，在孵育条件下可获得重组加合物（Spy蛋白，ST/SC），该加合物具有与野生型CnaB2结构域相同的折叠结构，其中Lys与Asp残基之间的异肽键自发形成。

Spy系统已被广泛用于开发多种生物技术工具，包括融合蛋白的连接、蛋白质环化（SpyRing）以增强酶的热稳定性、与其他标记系统（如生物素/链霉亲和素）联用构建高阶组装体、蛋白质水凝胶和纳米颗粒的修饰，以及控制蛋白质的多聚化状态。近期，首个过渡金属结合ST肽并形成新型人工金属酶的例子已被报道，其中在ST序列中引入了ATCUN基序以紧密结合铜(II)离子，所得ST/SC构建体保持铜配位并表现出相关的金属促进氧化活性。

除铜外，铁尤其是血红素铁是金属蛋白和金属酶的重要辅因子，其活性涵盖电子传递到化学上要求苛刻的氧原子插入反应。血红素蛋白的催化多样性为仿生化学和人工含血红素金属酶的开发提供了深刻启示。本研究旨在利用ST/SC系统开发新型人工血红素酶，以活性氧（ROS）为底物促进氧化还原反应。为此，研究人员合成了两种含血红素结合位点的ST序列，在表征其与血红素相互作用后，研究了相应血红素-ST/SC复合物的性质。这些生物启发系统的预期功能是ROS调控，因此测试了其过氧化物酶样和过氧化氢酶样伪酶活性，并通过Cu/O₂/抗坏血酸体系产生的部分还原氧物种监测肽/蛋白氧化，分析了这些系统作为ROS清除剂的能力。该论文发表在《Journal of Inorganic Biochemistry》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了紫外-可见分光光度滴定法（UV-Vis spectrophotometric titration）测定血红素与ST肽及ST/SC加合物的结合常数；高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）确认ST/SC加合物的形成及异肽键的生成；圆二色光谱（circular dichroism，CD）分析血红素结合对蛋白质二级结构的影响；动力学实验评估过氧化物酶样活性，以3-(4-羟基苯基)丙酸（HPA）为模型底物监测氧化产物在300 nm处的吸收变化；采用Cu/O₂/抗坏血酸体系评估各组分的ROS清除能力。

三、研究结果

3.1 ST和SC序列及性质

研究设计了两种ST肽（ST-1和ST-2），两者均包含共识序列IVMVD（含参与异肽键形成的天冬氨酸残基）和His-His串联基序（提供血红素锚定位点）。ST-2额外含有VPT片段和带正电荷的C端KRYK尾，可加速加合物重组反应。SC蛋白（SpyCatcher002版本）中引入了H37Q和H73Q两点突变，以去除SC序列内潜在的血红素配位残基，确保蛋白不能通过配位键直接与血红素相互作用。

3.2 血红素-ST复合物的紫外-可见结合研究

在生理pH水溶液中，血红素以单体和π-π二聚体的平衡混合物存在。向血红素溶液加入含组氨酸肽段后，Soret带出现低色效应（对应1:1五配位高自旋复合物形成）和轻微红移（对应1:2六配位低自旋复合物形成）。ST-1和ST-2均主要形成五配位复合物，六配位复合物形成可忽略。研究发现血红素-(ST)₂复合物在水溶液中倾向于沉淀，这解释了高肽浓度下Soret带的强烈下降和微弱的红移效应。通过拟合结合数据，ST-1的logK₁约为4.9-5.1，ST-2的logK₁约为5.9-6.1，表明1:1复合物具有中等亲和力，与含组氨酸的神经退行性疾病相关蛋白肽段（如β-淀粉样蛋白、tau蛋白和朊蛋白）与血红素的相互作用常数相当。K₂值因沉淀影响无法精确确定。改变血红素浓度、缓冲液离子强度和添加DMSO等条件均未显著改变结合常数。

3.3 ST/SC加合物的形成与HPLC-MS/MS分析

HPLC-MS/MS分析确认了ST-2/SC和ST-1/SC加合物的形成。ST-2与SC在仅5分钟孵育后即实现定量转化，而ST-1在24小时后转化仍不完全，产率约70%。这一结果与肽段设计策略一致：ST-2包含的VPT加速基序和带正电荷尾部显著增强了重组动力学。基于此，仅完全重组的ST-2/SC加合物被选用于后续分析，ST-1保留作为参照肽。

3.4 血红素-ST-2/SC复合物的紫外-可见结合研究

与游离ST-2肽的滴定不同，用ST-2/SC加合物滴定血红素时未观察到低色效应，仅检测到轻微红移和基线吸收的轻微增加，提示溶液中存在引起光散射的大颗粒。研究人员将有限的谱图变化解释为血红素与ST-2/SC加合物之间发生弱相互作用，同时伴有蛋白的初期聚集倾向。为进一步研究，使用含甘氨酰-L-组氨酸甲酯残基修饰的血红素（hemin-GH）作为模型化合物。hemin-GH与ST-2滴定出现强烈红移，表明形成六配位低自旋复合物；与SC蛋白滴定无显著红移（因SC缺乏配位His）；与ST-2/SC滴定仅出现中度红移，表明铁与ST-2/SC中His之间存在弱相互作用，但未形成N_His-Fe³⁺配位键。

3.5 圆二色光谱分析

远紫外CD光谱显示，SC呈现与其主要β-折叠结构一致的低强度CD谱，血红素添加不显著改变其谱图，确认血红素不与SC相互作用。无结构的ST-2肽呈现近似平坦的CD谱，血红素添加引起195-205 nm区域向正值和215-225 nm区域向负值的微小变化。重组ST-2/SC呈现与Catcher蛋白类似的β-折叠样结构，血红素添加在约198 nm处轻微影响结构，表明当肽段接枝到Catcher后仍部分保留结合血红素的能力。研究指出，可见区CD（Soret区诱导Cotton效应）需要刚性、高度定义的手性环境，对于高自旋五配位或未配位的血红素通常CD沉默，因此该区域表征可能不具结论性。

3.6 血红素结合ST肽和ST/SC加合物的过氧化物酶活性

以HPA为模型底物测试了血红素复合物活化过氧化氢的过氧化物酶样活性。动力学结果显示，增加ST-1和ST-2浓度可提高初始反应速率（相对游离血红素），其中ST-1的增强效应更显著；而ST-2/SC加合物的添加仅使游离血红素反应活性略有增加。这表明血红素-ST肽复合物对过氧化氢活化的氧化反应表现出增强的反应活性，而SpyTag/SpyCatcher加合物对血红素反应活性无显著影响。

3.7 过氧化氢酶样活性和ROS清除能力

研究还测试了各体系的过氧化氢酶样活性（将H₂O₂歧化为水和氧气），结果表明两种体系均未表现出实质性的过氧化氢酶样活性。在ROS清除能力分析中，所有受试组分（ST肽、SC蛋白、ST/SC加合物及其血红素复合物）均表现出ROS清除作用，这可能是由于肽/蛋白骨架在氧化条件下发生了氧化修饰，从而消耗了活性氧物种。

四、讨论与结论

本研究系统探究了SpyTag/SpyCatcher系统作为人工血红素蛋白支架的可行性。研究证实ST肽可通过组氨酸残基以微摩尔级亲和力结合血红素，且血红素-ST肽复合物具有增强的过氧化物酶样活性。然而，当ST与SC重组形成加合物后，血红素的结合强度显著下降，仅存在弱相互作用而无法形成稳定的配位键，且对血红素的催化活性无显著增强作用。这一现象可能归因于肽段接枝到蛋白支架后，其构象自由度受限，His残基难以以最优几何取向与血红素铁配位。此外，1:2血红素-肽复合物的水溶性差和蛋白聚集倾向也增加了表征难度。尽管Spy系统在蛋白质工程领域应用广泛，但将其作为血红素结合支架仍需进一步优化，例如调整His基序的位置和数量、引入更刚性的配位环境或通过定点突变增强血红素结合口袋的形成。总体而言，该研究为基于Spy系统开发人工血红素蛋白提供了坚实的实验和方法学基础，明确了当前设计的局限性，为未来优化和开发更先进的人工血红素蛋白指明了方向。