血红素过氧化物酶内过氧化物诱导的空穴跳跃扩展其底物多样性与氧化还原信号传导作用

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Peroxide-induced hole hopping within heme peroxidases expands their substrate diversity and redox-signaling roles

　　

本聚焦综述阐述了研究人员对血红素过氧化物酶中H₂O₂诱导、血红素介导的空穴跳跃如何扩展其底物多样性进而扩展其生理功能的观点。首先，回顾了血红素过氧化物酶已报道的底物多样性和功能，并概述了氧化还原酶中的空穴跳跃。在简要介绍过氧化物酶化合物I（Compound I）形成之后，考虑了血红素周围残基对空穴向多肽捐赠的调节。随后简要讨论了文献中乳过氧化物酶和木质素过氧化物酶底物氧化的研究，重点关注通过空穴跳跃增加的底物多样性。最后，研究人员基于质谱法对其氧化蛋白形式（proteoforms）的表征，回顾了对酵母线粒体细胞色素c过氧化物酶（cytochrome c peroxidase，CCP）中空穴跳跃的广泛定位。研究人员对重组CCP和从酵母细胞分离的CCP的意外发现揭示了空穴跳跃如何为该血红素过氧化物酶解锁前所未有的生理功能。

血红素过氧化物酶中H₂O₂诱导的空穴跳跃扩展底物多样性与生理功能的机制解读

**一、研究背景**

血红素过氧化物酶广泛存在于古细菌、真细菌、原生生物、色藻、真菌、植物和动物等所有生命界中，在生物防御、细胞氧化还原稳态维持、激素生物合成、细胞外基质（ECM）中胶原蛋白的加工，以及植物细胞壁中木质素和木栓质等复杂聚合物的合成与分解中发挥关键作用。例如，乳过氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）是乳汁、唾液和泪液中的强效抗菌剂；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）富集于中性粒细胞中介导微生物清除；甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）驱动甲状腺激素合成；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）通过氧化吲哚-3-乙酸调控植物生长发育，并在医学诊断和免疫化学中作为检测酶广泛应用。木质素占地球生物量25%以上，白腐真菌分泌锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）、木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，LIP）和多功能过氧化物酶（versatile peroxidase，VP）三种血红素过氧化物酶来降解这一难处理的芳香族聚合物。线粒体细胞色素c过氧化物酶（cytochrome c peroxidase，CCP）传统上被认为主要负责利用酵母iso-1-细胞色素c（cyt c₁）作为还原底物，将电子传递链（ETC）产生的H₂O₂清除为H₂O。

尽管血红素过氧化物酶在结构上高度相似，它们却能够通过H₂O₂催化多种底物的单电子和双电子氧化，底物涵盖芳香族和非芳香族有机分子、阳离子、阴离子、肽和蛋白质。这种底物多样性的分子机制长期以来未被完全阐明。空穴跳跃是指蛋白质中一个氨基酸残基上产生的电子空穴通过相邻残基的电子捐赠而转移的过程，如此重复多次形成一条穿过酶的跳跃路径。核糖核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase，RNR）是研究空穴跳跃的范式，其Y122残基上产生的空穴可经32 ?长距离跳跃至C439，启动DNA合成中核糖核苷酸的还原。Gray和Winkler提出，当O₂或H₂O₂过量时，通过Tyr和Trp残基链的空穴跳跃执行保护功能，将空穴从活性位点转移至蛋白质表面，由谷胱甘肽（glutathione，GSH）等细胞还原剂清除。然而，不同血红素过氧化物酶多肽中可氧化残基数目的显著差异——如MnP无Tyr且仅有1个Trp，LIP无Tyr但含3个Trp，而哺乳动物过氧化物酶和酵母CCP富含可氧化残基——提示空穴跳跃可能同时具有代谢和保护功能。因此，系统研究空穴跳跃如何扩大血红素过氧化物酶的底物多样性，对于全面理解其生理功能具有重要意义。

**二、主要技术方法**

该研究综合运用了多种关键生物物理和生化技术。研究人员采用高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定重组CCP及从酵母细胞中分离的CCP蛋白形式中的氧化修饰残基，据此绘制空穴跳跃路径。利用多频电子顺磁共振（EPR）波谱结合共振拉曼光谱检测和分析LPO及LIP中的蛋白质自由基。通过定点突变（如W191F、W171F、W171S、E250Q、E168Q等）验证关键残基的功能。采用量子力学/分子力学（QM/MM）计算方法研究空穴在W171和卟啉之间的分布及转移特性。此外，还运用了紫外-可见光谱、荧光光谱、ENDOR波谱、磁性测量和穆斯堡尔谱等技术。酵母样本来源包括发酵型和呼吸型酵母细胞的线粒体蛋白形式及胞外CCP蛋白形式。

**三、研究结果**

**3.1 LPO中的空穴跳跃**

LPO/H₂O₂/SCN^?系统是哺乳动物非特异性免疫防御的关键组分。研究表明，LPO在缺乏血红素可达供体底物时，其Por^•+Fe^IV=O中间体会快速转变为Tyr^•Fe^IV=O物种。Y312是离血红素最近的可氧化芳香族残基，距离卟啉环CBC原子4.1 ?，被认定为空穴跳跃的门控残基；其与远端W103相距3.8 ?，后者又分别与Y193、W529和W530相距约11 ?，形成自血红素出发的潜在跳跃分支点。最新EPR和共振拉曼研究证实了Y21和Y193是低pH和高pH条件下形成的两种不同Tyr^•Fe^IV=O中间体的自由基位点。LPO能氧化维生素K