红脂大小蠹成虫滞育终止及滞育后生殖发育期间的内分泌与分子动态变化

《Journal of Insect Physiology》：Endocrine and molecular dynamics during diapause termination and post-diapause reproductive development in adult Dendroctonus rufipennis

　　

• 综合解剖学、内分泌学和转录组学分析揭示了红梢小蠹越冬休眠终止过程中的关键机制。

• 生殖成熟仅发生在温度回升之后，而非低温暴露期间。

• 雌性昆虫20E持续维持高水平；雄性20E短暂性升高，与此同时JH III逐渐积累。

• Shade、Kr-h1和Schlank基因呈现时间特异性和性别特异性的表达模式。

引言

昆虫是地球上种类最为丰富的生物类群，广泛分布于几乎所有陆地生态系统，从赤道延伸至极地地区（Stork, 2018）。栖息于温带、亚北极和北极地区的物种已演化出一系列生理适应机制以抵御寒冷环境（Bale and Hayward, 2010）。在严酷冬季条件到来之前，昆虫会表现出多种发育反应，从发育速率的改变到完全的发育停滞不等。这些反应使昆虫能够耐受恶劣环境，并将其生活史与有利的季节条件相匹配（Denlinger, 2002; Ko?tál, 2006）。

休眠的概念最早于1893年被提出，用于描述与冬季蛰伏相关的发育停滞状态（Tougeron, 2019）。这是一种季节性的适应策略，是对季节性环境变化的遗传编程、预防性反应（Denlinger, 2008）。昆虫休眠通常分为兼性休眠，即由特定环境信号诱导产生，和专性休眠，即在每一代的特定生活史阶段固定发生，不受外部环境条件影响（Denlinger, 2002; Ko?tál, 2006; Hodek, 2012）。休眠是一条独特的发育轨迹，遵循一系列典型的发育阶段，包括启动、维持、终止、休眠后滞止和休眠后恢复等（Schebeck et al., 2024）。休眠的一个关键定义特征是，当有利条件恢复时，发育停滞不能立即被终止（Denlinger, 2002）。相反，发育的恢复需要暴露于特定的环境信号，如低温、水分、食物供应或光周期（Hodek, 2002）。这一机制使休眠昆虫免受短期环境波动的影响，防止在条件不利或即将变得不利时过早启动发育和繁殖（Yoshida et al., 2025）。如果休眠在有利条件已经出现时终止，昆虫将直接进入休眠后恢复阶段。如果休眠在不利的条件下终止，昆虫将通过环境诱导的滞止保持休眠状态，但一旦环境条件变得适宜，即可迅速恢复个体发育和生殖成熟（Zhang et al., 2020; Schebeck et al., 2024）。尽管休眠作为季节性适应策略已受到广泛研究，但控制其终止的生理和分子机制，特别是在表现出专性休眠的物种中，仍然知之甚少。

松小蠹Dendroctonus rufipennis Kirby, 1837（鞘翅目：象甲科，小蠹亚科）是传播最广的森林害虫之一，影响加拿大和美国广大地区的云杉（Picea）森林（Bentz et al., 2010）。所有北美云杉物种及其已知杂交种均可作为潜在寄主（Bleiker, 2021）。尽管D. rufipennis优先侵害受胁迫或近期风倒的云杉树，但一旦优先寄主资源耗尽，高密度种群可侵袭并杀死健康寄主，导致大面积森林死亡（Bleiker and Safranyik, 2021）。该物种的发育生物学尤为值得关注，因为它在不同生活史阶段表现出兼性休眠和专性休眠两种类型（Bleiker and Willsey, 2020; Bleiker and Safranyik, 2021）。D. rufipennis幼虫通常在晚秋化蛹前进入兼性休眠（Hansen et al., 2011）。根据田间观察，成虫表现出专性休眠，即新生成虫在分散到新寄主树并繁殖之前，总是先越冬一次，无论其生活史持续时间如何（Knight, 1961; Hansen et al., 2001）；实验室研究也发现，在缺乏低温期的条件下，成虫从树皮中钻出存在显著延迟（Bleiker and Meyers, 2017; Bleiker and Willsey, 2020）。这种成虫休眠，通常被称为生殖休眠，其特征是生殖功能的抑制（Hodek, 2012）。解剖学研究已表明，雌性D. rufipennis在休眠期间卵巢发育受到抑制（Davenport et al., 2025）。同属物种Dendroctonus pseudotsugae Hopkins, 1905的证据表明，雄性副性腺在低温暴露之前不会发育（Ryan, 1959; Cerezke, 1964）。然而，专性休眠是否同样抑制雄性甲虫的生殖发育尚不清楚。

内分泌信号传导，特别是涉及20-羟蜕皮酮（20E）和保幼激素（JH）的信号通路，在调控多种形式的昆虫休眠中发挥核心作用（Guo et al., 2021a; Hafeez et al., 2025; Tian et al., 2025）。JH的缺乏被广泛认为是诱导雌雄昆虫生殖休眠的关键因素（Denlinger et al., 2012）。保幼激素存在多种异构体，包括JH 0、JH I、JH II、JH III、JH III双环氧化物和甲基法尼酯。其中，JH III在昆虫纲中分布最广，也是目前在鞘翅目中发现的唯一形式（Trautmann et al., 1976; Goodman and Cusson, 2012）。20-羟蜕皮酮通过与胞内蜕皮激素受体结合触发信号级联反应，从而调控下游激素通路，包括影响JH合成的通路（Meiselman et al., 2017）。值得注意的是，20E水平升高已被证实可促进JH生物合成，从而有助于休眠终止（Guo et al., 2021a）。

这些内分泌通路在分子层面还受到20E生物合成和JH信号相关基因协调表达的进一步调控。20E的生物合成主要依赖一系列细胞色素P450酶的催化活性（Gilbert et al., 2002; Scanlan et al., 2023），统称为"万圣节基因"（Rewitz et al., 2006; Niwa and Niwa, 2014）。其中，Shade基因编码CYP314A1蛋白，催化蜕皮酮羟基化生成20E，这是20E生物合成途径的最后一步（Petryk et al., 2003）。Krüppel同源物1（Kr-h1）是一种含有八个C2H2锌指结构的转录因子，作为JH的早期反应基因，介导其抗变态和促生殖效应（Kayukawa et al., 2017; He and Zhang, 2022）。保幼激素诱导甲氧苄二异丁氨基嘧啶耐受型（Met）受体与转录因子Taiman形成异源二聚体，特异性结合Kr-h1启动子以激活其转录（Jindra et al., 2021; Guo et al., 2021b）。此外，JH通过细胞膜介导的非经典信号通路（Liu et al., 2015）和表观遗传修饰（He and Zhang, 2022）正向调控Kr-h1的表达。JH还可通过不依赖于Kr-h1的机制，经Met受体抑制Schlank的表达（Yuan et al., 2024）。Schlank既作为神经酰胺合酶又作为转录调控因子发挥作用，提示JH信号与代谢调控之间可能存在潜在联系（Bauer et al., 2009; Sociale et al., 2018; Zhang et al., 2026）。

具有冬季休眠的昆虫在休眠终止前后往往不表现出明显的形态变化（Hayward et al., 2005; Ko?tál, 2006），使得精确界定该过程较为困难。以往研究通常依赖休眠维持期与休眠后状态之间可见性状差异来推断终止的发生（Zhou et al., 2022; Yang et al., 2023; Wu et al., 2024），但此类方法忽略了休眠后恢复期间的动态生理转变。D. rufipennis为克服这一局限提供了理想的研究体系，因为其新生成虫无需诱导即可自发进入专性休眠，且仅在经历低温暴露后才大规模离开寄主树侵殖新寄主并繁殖（Knight, 1961; Hansen et al., 2001），这使得休眠维持期和休眠后恢复期能够被清晰区分。本研究旨在利用精细化的休眠阶段定义，表征D. rufipennis休眠终止期间的形态和生理变化。我们首先比较了低温处理前后成虫生殖系统的发育状态，以确认生殖休眠的发生。随后，我们测定了低温暴露及后续恢复期间20E和JH浓度的动态变化。最后，我们评估了Shade基因作为20E生物合成激活指示物的表达情况，并监测了Kr-h1和Schlank的表达以评估JH信号传导。综合而言，这些发现阐明了休眠终止和休眠后恢复的内在机制，同时为理解这些生态和经济上重要的森林害虫的扩散和暴发动态提供了机制基础。

节段

昆虫饲养与处理

活的成虫D. rufipennis来自加拿大自然资源部加拿大森林服务局（加拿大不列颠哥伦比亚省维多利亚市）维持的实验室种群。甲虫采自加拿大不列颠哥伦比亚省克兰布洛克东北部森林（北纬50° 12′ 53.6″，西经114° 58′ 45.1″）。每对5对成虫被放入一根单株云杉（Picea glauca）木材中（直径25–30厘米，长35厘米）以启动侵殖。木材取自埃德森东南方一棵近期被砍伐的云杉树。

低温终止休眠与回温启动两性生殖成熟

与其他组相比，分散期雌虫表现出显著膨大的卵小巢，其中可见明显的卵细胞，呈"串珠状"形态（图1A）。定量分析显示，分散期雌虫的卵小巢长度显著大于其他各组（图2B）（Welch's ANOVA: F = 282.81; df = 3, 85.26; P < 0.001）。R90组与NA组之间（Games-Howell: P = 0.737）以及C75组与NA组之间的卵小巢长度无显著差异（图2B）。

讨论

我们观察到，经过75天低温暴露随后转移至温暖条件下，成虫D. rufipennis发生了生殖成熟。有趣的是，低温暴露期间20E生物合成短暂性升高，而JH III则逐渐积累。我们进一步发现，参与20E生物合成的基因在低温处理的前25天内表达量增加。相比之下，两个JH III响应基因——Schlank和Kr-h1——表现出截然不同的性别特异性表达模式。

结论

尽管低温通常与代谢抑制相关（Gillooly et al., 2001; Brown et al., 2004），我们的结果表明，D. rufipennis成虫在低温暴露期间持续进行着与低温诱导休眠终止相关的分子和内分泌过程。新生D. rufipennis成虫经历一种以生殖系统未成熟为特征的生殖休眠。休眠终止在低温暴露的最初25天内启动，并在第75天完成。在此期间……

CRediT作者贡献声明

Hongzhi Zhang：撰写—审阅与编辑，撰写—原稿，可视化，验证，方法论，调查，形式分析，数据管理，概念化。Yanzhuo Liu：可视化，方法论。Katherine P. Bleiker：撰写—审阅与编辑，资源提供。Haolin Wei：撰写—审阅与编辑，调查。Ziyu Shao：数据管理。Nadir Erbilgin：撰写—审阅与编辑，指导，资源提供，项目管理，资金获取，概念化。

资金

本研究由加拿大自然科学和工程研究理事会—发现奖资助NE，以及中国国家留学基金管理委员会资助（202009120006）。

未引用参考文献

Zhang et al., 2020

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

我们感谢加拿大自然资源部加拿大森林服务局劳伦锡安林业中心的Christopher I. Keeling博士对本稿件提出的宝贵意见和建议。

Hongzhi Zhang | Yanzhuo Liu | Katherine P. Bleiker | Haolin Wei | Ziyu Shao | Nadir Erbilgin