《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：Pharmacological modulation of GLI signaling promotes human iPSC-derived cardiomyocyte maturation via PGC1α-associated mitochondrial programs
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GLI信号通路调节驱动了2D和3D工程心脏组织中hiPSC-CMs的结构和功能成熟。
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GLI信号通路调节驱动了2D和3D工程心脏组织中hiPSC-CMs的结构和功能成熟。
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这种干预诱导了hiPSC-CMs的稳定成熟过程。
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由此产生的表型包括线粒体网络复杂性、拷贝数和生物发生能力的增加。
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从机制上看，成熟过程是通过PGC1α依赖的转录程序实现的。
引言
心肌细胞（CM）的成熟是一个复杂的过程，涉及从胎儿到成年阶段的结构、功能和电生理重塑[1][2][3]。这一转变受到高度协调的转录和信号通路网络的严格控制[3][4]。明确CM成熟的分子基础对于充分利用人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）在心脏再生、疾病建模和药物发现方面的潜力至关重要[5][6]。
尽管先进的分化方案可以提供无限的hiPSC-CMs供应，但目前的方法主要产生具有胎儿样转录、表观遗传和代谢特征的CMs，这限制了它们作为治疗发现试验平台的准确性[2][4]。具体来说，不成熟的hiPSC-CMs具有较不发达的收缩装置、较低的传导速度、较低的线粒体含量和不成熟的代谢特征[4][7]。因此，确定促进hiPSC-CMs成熟的新机制对于有效进行心脏疾病建模和治疗测试至关重要。已经测试了许多策略来促进hiPSC-CMs的成熟[3]。例如，长期培养[8]、共培养[9][10]、培养基配方[2]、电刺激[11]、流体动力学处理[12]和机械刺激[4]已被证明可以诱导hiPSC-CMs的成熟。还有一些方法结合了小分子如甲状腺激素、地塞米松和胰岛素样生长因子-1来提高hiPSC-CMs的成熟度[12][13]。同样，通过渐进式电处理的3D工程心脏组织（EHT）方法产生了具有有序超结构、t-tubules、氧化代谢和正能量-频率关系的CMs[4]。这些方法已被证明可以改善hiPSC-CMs的功能基因表达、增加肌节长度并提高收缩功能[2][3][12]。虽然这些策略改善了功能基因表达、肌节组织和收缩性能，但许多方法依赖于复杂的平台或长时间的培养，而不是模拟内在的发育成熟过程。基于发育信号的方法可能更好地模拟体内CM的成熟动态并保持适当的组织结构。
从代谢角度来看，不成熟的CMs主要依赖于糖酵解，而成熟的成年CMs主要利用脂肪酸氧化（FAO）来产生ATP[2][14]。这种代谢转换伴随着线粒体生物发生的增加[14]，这是通过激活过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α（PGC1α）调控的通路实现的[14][15]。PGC1α是CMs中线粒体生物发生和能量代谢的中心调节因子[16]。PGC1α与核呼吸因子1（NRF1）和线粒体转录因子A（TFAM）等转录因子相互作用，以控制调控线粒体生物发生和能量代谢的基因[17][18]。PGC1α的敲除会导致线粒体生物发生减少、氧化磷酸化受损和心力衰竭[19][20]。这些发现强调了PGC1α在调节心脏线粒体动态中的关键作用。尽管PGC1α在调节线粒体生物学中的功能已经明确[15][20]，但它与其他信号通路在CM成熟过程中的相互作用仍不清楚。
以往的研究表明，Hedgehog（HH）-GLI（胶质瘤相关致癌基因同源物）信号通路在心脏发育和成熟中起着关键作用[21][22]。动物模型的研究表明，Gli1?/?小鼠没有心脏缺陷，而Gli1?/?;Gli2+/?;Gli3+/?复合突变体会在出生时死亡，Gli2?/?;Gli3+/?复合突变体则表现出心脏流出道的畸形[23][24]。最近的研究表明，GLI/HH信号通路作为发育时钟来控制心脏前体（CP）的分化时机，持续的Gli1活性足以通过维持前体相关的基因调控程序来延迟CP向CM的转变[25]。因此，这项工作定义了GLI信号通路在CM定向之前的作用。GLI信号通路是否在CM之后继续对其后续的结构和代谢成熟起作用仍不明确。将GLI因子的机制作用联系起来将加深我们对它们在CM发育和成熟过程中的功能的理解。
在本研究中，我们证明了使用GANT61进行短期（2-4天）的GLI信号通路药物调节能够以浓度依赖的方式增强早期hiPSC-CMs的成熟。GANT61处理促进了2D单层培养和3D EHT中的结构、功能、电生理和代谢成熟。GLI通路的药物或基因激活导致了CM成熟程序的减少。从机制上看，GLI信号通路的调节是通过激活PGC1α通路及其下游效应因子NRF1和MFN2来促进CM成熟的。阻断PGC1α通路减弱了GANT61诱导的结构和功能变化。这些发现表明GLI信号通路是hiPSC-CMs成熟的重要调节因子，并为增强hiPSC衍生心脏模型的生理相关性建立了可扩展的框架。
章节片段
hiPSC培养和hiPSC-CM分化
本研究使用了两种独立的hiPSC系：1) hiPSC-MLC2v-EGFP（由Washington州西雅图Allen细胞科学研究所Ruwanthi N. Gunawardane博士的实验室生成并共享[26]，并得到明尼苏达大学Rita R. C. Perlingeiro博士实验室的慷慨提供[27]；2) CF-hiPSC系（由健康女性捐赠者的心肌纤维细胞重新编程[27]，并得到明尼苏达大学Brenda Ogle博士实验室的慷慨提供[28]）。
GLI调节促进不成熟心肌细胞的成熟
我们之前的研究表明，GLI2通过CKS1B通路调节CM的增殖[22]。为了研究GLI信号通路在CM发育和成熟中的潜在作用，我们重新分析了我们在使用HH/GLI抑制剂GANT61（全GLI抑制剂）处理48小时后从新生小鼠CM中获得的已发表的RNA-seq数据集[22]。我们首先分析了这些数据集中上调的转录本，并研究了其中丰富的生理功能。
讨论
尽管hiPSC-CMs作为再生医学、疾病建模、毒性和药物筛选的有希望的平台而出现[65][66][67]，但它们的不成熟表型限制了其全面的转化潜力[67][68]。已经探索了多种方法，包括培养基配方[2]、生物力学[11]、化学[13]和遗传策略，以促进它们向成熟表型的转化，从而改善功能和生理特性[4]。然而，即使是最先进的方法...
结论
在这项研究中，我们确定GLI信号通路是hiPSC-CMs成熟的一个调节因子。我们的发现表明，GLI信号通路的药物调节在2D和3D系统中诱导了转录、结构、功能和代谢变化，使hiPSC-CMs向更成熟的表型转变。此外，我们表明这种成熟诱导并非由组织微环境引起，而是CM本身的效应。从机制上讲，我们支持PGC1α...
人工智能（AI）披露
本研究中没有使用AI辅助技术（除了检查语法和拼写）。
CRediT作者贡献声明
Mohammad Shameem：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、验证、方法论、正式分析、数据管理。 Ahmed Sharara：撰写 – 原始草稿、软件、正式分析、数据管理。 Ina Xhelilaj：撰写 – 审稿与编辑、软件、方法论、正式分析、数据管理。 Joseph Sushil Rao：正式分析、数据管理。 Hassan Salih：方法论、正式分析、数据管理。 Ezequiel Marron Fernandez de Velasco：撰写 – 原始草稿、资源管理。
资助
这项研究得到了明尼苏达再生医学（RMM 091718 DS 007）和明尼苏达大学医学院康复医学系的资助。
致谢
我们感谢明尼苏达大学医学系的Rita R. C. Perlingeiro博士分享hiPSC-MLC2v-EGFP系，以及明尼苏达大学生物医学工程系的Brenda Ogle博士分享CF-hiPSC系。我们还要感谢明尼苏达州罗切斯特Mayo诊所的Martin E. Fernandez-Zapico博士分享pcDNA3.1 GLI2构建体。同时，感谢Wei-Han Lin在EHT准备方面的帮助，Casey Kraft在收缩力分析方面的帮助，以及Akhilesh Kumar...
Mohammad Shameem | Ahmed Sharara | Ina Xhelilaj | Joseph Sushil Rao | Hassan Salih | Ezequiel Marron Fernandez de Velasco | Baibrab N. Singh
