唯一分子标识符家族大小在儿童癌症肿瘤知情循环肿瘤DNA分析中的影响

《The Journal of Molecular Diagnostics》：The effect of unique molecular identifier family size using tumor-informed circulating tumor-DNA analysis in childhood cancers

　　

循环肿瘤DNA（ctDNA）分析提供了一种分子评估手段，可补充儿童癌症管理中的常规影像学检查。对ctDNA水平的详细监测可提供关于治疗疗效和耐药性的信息，有助于发现微小残留病，并能够实现复发的早期检测。本研究将肿瘤知情ctDNA分析应用于8名恶性肿瘤患儿收集的90份血浆样本。采用SiMSen-Seq（一种利用唯一分子标识符（UMI）的数字测序方法）对每名患者的4至10个肿瘤特异性突变进行评估。研究人员评估了单个SiMSen-Seq检测和血浆样本在背景错误率、检测到的靶分子数量以及使用不同UMI家族大小截断值进行突变检出方面的影响。使用每个UMI至少两条测序读段可获得最佳整体性能，因为该方法能产生最高数量的检测靶分子，从而提供检出低频突变的最佳机会。不同SiMSen-Seq检测和血浆样本之间的数据保持一致，为所有患者提供了随时间变化的稳健ctDNA分析结果。总之，研究结果表明，在肿瘤知情ctDNA分析中优化使用UMI能够实现灵敏的分子读数，有助于儿童癌症的管理。

儿童癌症肿瘤知情循环肿瘤DNA分析中唯一分子标识符家族大小的影响——论文解读

一、研究背景与意义

尽管过去几十年儿童癌症管理取得了显著成就，但在评估治疗疗效和早期检测复发方面，临床上仍需要改进的分析方法。影像学技术是监测实体瘤的金标准，但在灵敏度和特异性方面存在局限性。补充性的液体活检分析可提高检出率，并提供分子信息以帮助指导治疗决策和优化放射学检查时机。特别是循环肿瘤DNA（ctDNA）作为儿童恶性肿瘤的灵敏生物标志物显示出前景，甚至可在肿瘤细胞产生转移灶之前被检测到。ctDNA水平与肿瘤负荷相关，耐药基因中的特定突变可为治疗选择提供信息。

在肿瘤知情ctDNA分析中，由于仅评估预先鉴定的肿瘤特异性突变，与未知（agnostic）方法相比，假阳性结果的风险较低。为鉴定肿瘤特异性突变，通常对原发肿瘤和匹配的胚系DNA进行全基因组或全外显子组测序，利用这些突变设计个性化ctDNA panel，用于分析诊断时及后续时间点收集的血浆样本。肿瘤知情ctDNA分析的发展对儿童癌症尤为重要，因为儿童癌症以少数复发性突变（recurrent mutations）为特征。标准测序方法通常具有约1%–5%等位基因频率（allele frequency）变异的临床灵敏度，但许多基于ctDNA分析的应用需要更高的灵敏度。数字测序方法可检测频率低于0.1%的变异等位基因，主要分为两大类：基于PCR的方法（如SiMSen-Seq、Safe-SeqS和BiSeqS）和基于连接（ligation）的策略（如DupSeq、TARDIS、CODEC和GeneBits）。这些方法利用文库构建过程中引入的唯一分子标识符（unique molecular identifiers，UMI），UMI通常为6–12个核苷酸的随机化DNA序列，可唯一标记每个靶DNA分子。测序后，具有相同UMI的读段被折叠为一个共有读段（consensus read），因为它们均源自同一DNA分子。通过多次评估每个原始靶分子，可校正聚合酶诱导的错误和定量偏差。然而，在肿瘤知情ctDNA分析中，应用不同UMI家族大小（即具有相同UMI的读段数量）截断值的影响研究仍不充分。

二、研究设计与关键方法

研究人员对8名患有横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma）、骨肉瘤（osteosarcoma）、肾母细胞瘤（Wilms tumor）、滑膜肉瘤（synovial sarcoma）或生殖细胞肿瘤（germ cell tumor）的儿童进行了纵向监测，共分析90份血浆样本。主要技术方法包括：利用全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）鉴定每名患者的体细胞突变，通过Sarek流程进行体细胞变异检出，结合Mutect2、Strelka2和Freebayes三种变异检出工具；采用SiMSen-Seq数字测序方法进行ctDNA分析，该方法包含两轮PCR，第一轮PCR中靶DNA被UMI标记（UMI长度为12个核苷酸），第二轮PCR添加测序接头；使用UmiErrorCorrect生物信息学流程（v.0.29）进行数据分析，将读段比对至hg38参考基因组，并通过统计模型进行变异检出；此外还进行了理论计算，评估SiMSen-Seq中每个DNA分子产生的UMI数量分布。

三、研究结果

测序错误校正与UMI家族大小截断值无关

对8名患者90份血浆样本的肿瘤知情ctDNA分析中PCR和测序诱导错误的分布进行了计算。使用UMI家族大小≥2时，背景错误率与不使用UMI相比平均降低55倍（0.007%对比0.366%）。将UMI家族大小截断值从2增加至30，平均背景错误率无显著变化，维持在0.004%至0.006%之间。大多数原始测序错误为颠换（transversion，92.2%），转换（transition，7.8%）、缺失（0.5%）和插入较少。UMI校正后，大多数替换错误被校正，颠换与转换之间的频率差异缩小（58.6%对比41.4%）。在66个检测中，仅5个检测的平均错误率超过0.01%，其中SPN和ZNF827两个检测超过0.02%。三因素方差分析显示检测和样本对背景错误率有显著影响（p < 10^-20），而UMI家族大小截断值无显著影响。研究还通过具体示例展示了UMI错误校正的效果：在PCDHGA4检测中，背景错误率从0.185%降至0.005%，降低37倍；在CHD5检测中，错误率从0.474%降至0.004%，降低119倍，且未使用UMI时检出的突变读段被证实为假阳性。

检测分子数量依赖于UMI家族大小截断值

在SiMSen-Seq中，每个双链DNA分子平均产生2.22个UMI（假设100%靶扩增效率）。检测到的DNA分子数量随UMI家族大小截断值的增加而减少。使用UMI家族大小≥2时，可检测到19.1%的DNA分子（通过荧光分析评估），而使用≥30时仅检测到9.1%。SiMSen-Seq检测到的分子数量与文库构建中输入的细胞游离DNA量呈线性相关，表明DNA输入量是样本间检测分子数量差异的主要因素。检测分子数量也依赖于具体检测，患者特异性panel中表现最佳与最差检测之间的差异范围为1.4倍（患者3）至19倍（患者7）。每个样本和时间点的平均检测分子数量范围为22.5至8070。研究得出结论，UMI家族大小≥2在最小化错误率的同时最大化检测分子数量方面是最优选择。

治疗和随访期间的ctDNA临床评估

为监测治疗疗效、检测微小残留病和复发，对每名患者随时间变化的ctDNA进行了评估。使用UMI家族大小≥2，对所有检测的每毫升血浆ctDNA分子总数进行统计。样本定义为ctDNA阳性需至少检出一种突变（Q-score≥10）。5名有基线样本的患者在治疗开始前均呈ctDNA阳性，范围为每毫升血浆1.05至3855个ctDNA分子。患者1在化疗第一周期第0、1、2天采集的前三个样本均呈ctDNA阳性，分别有6、10和10个检测检出突变，总ctDNA水平在10个检测中峰值达每毫升血浆55.5个突变分子。治疗开始后所有样本转为ctDNA阴性，与良好的影像学反应和完全缓解相关。患者2在基线样本中ctDNA阳性（每毫升1.05个突变分子），治疗开始后持续低于检测限，直至计划肿瘤手术前一天采集的样本显示残留病灶（每毫升11.0个突变分子），术后三个样本ctDNA阴性。患者3–7在治疗开始前或开始时采集的首个样本ctDNA阳性，治疗期间及之后采集的样本均为阴性。患者8在入组前已行肿瘤手术，辅助化疗期间及之后所有样本ctDNA阴性。患者2和5在最后一次采血后6–7个月出现疾病复发，其余6名患者在最近随访时无病生存。

四、讨论与结论

研究确定了SiMSen-Seq在儿童癌症肿瘤知情ctDNA分析中UMI家族大小的影响。儿童恶性肿瘤与大多数成人癌症相比复发性突变较少，使依赖共享热点变异的未知panel不够充分。UMI能有效校正实验诱导的测序错误，实现单个细胞游离DNA分子的分析，从而促进低等位基因频率ctDNA的检测。ctDNA检测灵敏度也随评估突变数量的增加而提高。SiMSen-Seq panel设计在监测突变数量、单核苷酸变异和短插入缺失方面具有灵活性，并允许添加通用检测（如神经母细胞瘤靶向治疗中的ALK序列），因此可应用于儿童癌症管理的多个方面。研究证明UMI家族大小≥2在最小化错误率的同时最大化检测分子数量方面是最优的，低截断值从成本角度也很重要，因为数字测序需要深度测序。UMI的使用可在实验和生物信息学层面影响ctDNA检测以及细胞游离DNA分子数量的估计。变异检出基于统计模型，其中背景错误用β-二项分布描述，该模型对低变异等位基因频率突变的检测具有高灵敏度，检测分子总数和突变分子数量是关键变量。研究的局限性包括数据仅覆盖一种方法，未评估UMI家族大小以外的参数（如编辑距离、UMI长度或结构），特定癌症类型的患者数量也较少，因此研究结果具有技术价值而非临床价值。研究结论为：该研究证明了在儿童癌症中使用肿瘤知情ctDNA分析的可行性，存在多个实验和生物信息学因素可影响ctDNA评估的灵敏度，结果显示在SiMSen-Seq肿瘤知情ctDNA分析中应采用UMI家族大小≥2以获得最佳性能。