四棱豆茎皮灰烬衍生的盐对链脲佐菌素诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

《Applied Research》：Protective Effects of a Cissus quadrangularis Stem Peel Ash Derived Salt Against Streptozotocin Induced Cellular Injury in SH-SY5Y Cells

　　

中文摘要翻译 本研究探讨了从四棱豆（Cissus quadrangularis）茎皮灰烬中提取的一种盐（CQS）对链脲佐菌素（STZ）诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的抗氧化和保护作用。研究人员将CQS制备为焚烧后茎皮灰烬的干燥水溶性组分，并通过定性植物化学筛选、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行表征。FT-IR显示存在多种官能团，而GC-MS检测到挥发性和半挥发性成分，其中4-叔丁基-2-(4-甲氧基苯基)-6-对甲苯基吡啶是最丰富的峰面积成分（20.79%）。在所测试的浓度范围内，CQS表现出递增的DPPH自由基清除活性，其半数抑制浓度（IC50）为56.47 μg/mL。MTT法测定表明，20 mM STZ将细胞活力降低至24.63%，而在STZ存在下用25 μg/mL CQS处理可将细胞活力提高至60.83%。STZ使具有高H2DCFDA荧光的细胞百分比增加至71.77%，并使胱天蛋白酶-3（caspase-3）表达增加至73.82%，而CQS处理分别将这些值降低至40.19%和36.61%。CQS还将保留线粒体膜电位的细胞比例从STZ组的21.02%提高至71.31%。这些发现表明，CQS可能减轻STZ诱导的SH-SY5Y细胞中的氧化应激、线粒体去极化和凋亡相关标志物。需要进一步的组成、机制和体内研究来确定其生物学活性和转化相关性。

论文解读文章

一、研究背景与目的

神经退行性疾病，如帕金森病（Parkinson's disease, PD），其特征是多巴胺能神经元进行性丢失，其发病机制涉及氧化应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡等关键通路。因此，寻找能够有效对抗这些病理过程的神经保护剂具有重要意义。链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）是一种葡萄糖类似物，可通过DNA烷基化、产生一氧化氮和自由基，诱导线粒体损伤和凋亡性细胞死亡，已被用于建立神经元的体外氧化应激和细胞毒性模型。人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系因其人类起源、神经元样形态、儿茶酚胺能特性以及易于培养等特点，被广泛用于神经毒性研究和潜在神经保护剂的初步筛选。然而，现有的治疗方法效果有限，促使研究者探索天然产物作为替代或辅助治疗策略。四棱豆（Cissus quadrangularis L.）作为一种传统药用植物，含有黄酮类、三萜类、酚类等多种植物化学成分，并已被证实具有自由基清除和抗氧化活性。基于此，本研究旨在探究一种从四棱豆茎皮灰烬中制备的生物盐（CQS）是否能够通过其抗氧化特性，保护SH-SY5Y细胞免受STZ诱导的氧化损伤、线粒体功能障碍和凋亡，从而评估其潜在的神经保护价值。该论文发表于《Applied Research》。

二、关键技术方法概述

为达成研究目标，研究人员采用了一系列关键技术方法：

1. 1.
   CQS制备与表征：通过焚烧、水提、太阳能蒸发干燥等方法制备CQS。利用定性植物化学筛选鉴定其主要植物化学成分类别；使用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析其官能团；运用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析其挥发性和半挥发性成分。
2. 2.
   细胞模型建立与评估：以人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系（来源于美国国家细胞科学中心，印度浦那）为研究对象，使用STZ建立氧化应激和细胞损伤模型。
3. 3.
   抗氧化与保护效应评估：通过DPPH自由基清除实验评估CQS的体外抗氧化活性。采用MTT法测定细胞活力。使用流式细胞术，结合H₂DCFDA荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）水平，使用JC-1染料检测线粒体膜电位（MMP）变化，并通过特异性抗体检测胱天蛋白酶-3（caspase-3）的表达水平。此外，还采用了吖啶橙/溴化乙锭（AO/EtBr）双染法，通过荧光显微镜观察细胞凋亡形态。

三、主要研究结果

3.1 定性植物化学分析

定性分析显示，CQS的水溶液中含有黄酮类、生物碱、蛋白质、氨基酸、酚类和鞣质，未检测到苷类、皂苷、甾体、碳水化合物、萜类和固定油。

3.2 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析

FT-IR分析显示CQS在400–4000 cm^-1范围内有多个吸收峰，表明存在烷基卤化物、芳香族化合物、磺酸盐、羧酸、烯烃、酯、醚、膦酸盐、硫酸酯、硅烷和膦等多种官能团。

3.3 气相色谱-质谱（GC-MS）分析

GC-MS色谱图揭示了CQS中存在10种主要的生物活性或植物化学化合物，包括乙二酸（2.85%）、十六烷（7.76%）、十九烷（18.09%）、十七烷（9.76%）、二十一烷（8.83%、8.90%、7.71%）、1-碘二十烷（7.77%）、十九烷基三氟乙酸酯（7.53%）和4-叔丁基-2-(4-甲氧基苯基)-6-对甲苯基吡啶（20.79%），其中后者为最丰富的成分。

3.4 抗氧化活性评估

DPPH自由基清除实验结果表明，CQS的清除活性呈浓度依赖性增强。在20、40、60、80和100 μg/mL浓度下，清除率分别为18.40%、36.90%、49.70%、71.20%和89.30%，其IC₅₀值为56.47 μg/mL，表明CQS具有良好的体外抗氧化能力。

3.5 CQS的细胞毒性分析

MTT实验结果显示，STZ以剂量依赖的方式降低SH-SY5Y细胞活力，20 mM STZ处理后细胞活力降至24.63%。CQS单独处理也呈现一定的浓度依赖性细胞毒性。在与20 mM STZ共处理时，CQS显示出非线性的保护作用，其中25 μg/mL CQS使细胞活力恢复至最高水平（60.83%），显著高于STZ处理组（p < 0.01）。因此，后续实验选用20 mM STZ和25 μg/mL CQS的组合。

3.5.1 活性氧（ROS）水平的测定

通过H₂DCFDA探针进行流式细胞术分析，对照组细胞的ROS阳性率为0.19%。经20 mM STZ处理后，ROS阳性率急剧升高至71.77%。而加入25 μg/mL CQS共处理后，ROS阳性率显著降低至40.19%，表明CQS能够有效抑制STZ诱导的细胞内ROS过度产生。

3.5.2 线粒体膜电位（MMP）活性的测定

JC-1染色流式细胞术结果显示，对照组中99.92%的细胞保持高MMP（健康状态）。STZ处理后，仅有21.02%的细胞保持高MMP，而78.69%的细胞发生线粒体膜去极化。CQS共处理显著改善了这一状况，使保持高MMP的细胞比例回升至71.31%，表明CQS有助于维持线粒体功能完整性。

3.5.3 凋亡的荧光显微镜检测

AO/EtBr双染荧光显微镜观察显示，对照组细胞主要为绿色荧光（活细胞）。STZ处理后，大量细胞呈现红色荧光（死细胞或凋亡细胞），并伴有核形态改变。CQS共处理组则观察到更多的绿色荧光细胞和更少的红色荧光细胞，表明CQS减少了STZ诱导的细胞凋亡。

3.5.4 胱天蛋白酶-3（Caspase-3）表达的测定

流式细胞术检测胱天蛋白酶-3表达，对照组表达水平仅为0.22%。STZ处理后，表达水平飙升至73.82%。CQS共处理将其显著降低至36.61%，表明CQS能够抑制STZ激活的凋亡信号通路。

四、讨论与结论

讨论部分总结：研究表明，CQS处理与改善细胞活力、减少活性氧、保护线粒体膜电位、降低胱天蛋白酶-3表达以及减少凋亡形态相关。这些效应可能归因于CQS中含有的黄酮类、酚类等抗氧化成分，其DPPH自由基清除活性也支持了这一观点。然而，CQS的保护效应呈非线性，最佳浓度为25 μg/mL，更高浓度可能因其自身轻微的细胞毒性而削弱保护效果。研究人员指出，当前的化学表征（定性分析、FT-IR、GC-MS）仅为初步分析，无法将观察到的效应归因于特定成分，且GC-MS主要检测挥发性成分，可能遗漏了重要的非挥发性极性化合物或矿物质。因此，需要进行LC-MS、元素分析和定量矿物分析来全面确定CQS的组成。

研究结论部分翻译：四棱豆茎皮灰烬衍生的盐（CQS）在STZ诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型中显示出抗氧化和细胞保护作用。CQS处理与改善细胞活力、减少细胞内ROS、保护线粒体膜电位、降低胱天蛋白酶-3表达以及减少凋亡形态相关。最大的保护效应在25 μg/mL CQS浓度下观察到，而更高浓度下的活力降低表明了非线性反应和可能的固有细胞毒性。由于CQS的化学和矿物组成仅通过定性植物化学测试、FT-IR和GC-MS进行了初步表征，因此观察到的效应不能归因于特定的成分。这些发现仅限于体外神经元应激模型；因此，在建立其治疗相关性之前，需要进一步的组成、机制、剂量优化和体内研究。