基于图像分析的淋巴瘤细胞异质性研究：CRYO与FFPE技术的比较

《Journal of Pathology Informatics》：Image-based analysis of lymphoma cell heterogeneity: Comparative study of CRYO and FFPE techniques

　　

病理组织图像中准确的细胞核分割是计算病理学定量分析的基石步骤。细胞或细胞核的人工标注耗时且存在观察者间差异，这推动了自动化方法的发展，以提高效率和可重复性。传统的分割方法，包括阈值法、分水岭算法和区域生长技术，常常受限于对染色变异性、图像噪声以及重叠细胞存在的敏感性，限制了其在复杂组织环境中的适用性。 淋巴组织的苏木精染色切片为自动化细胞核分割带来了特别具有挑战性的场景，原因在于高细胞密度、形态异质性以及相邻细胞核之间的低对比度。这些特征在淋巴瘤受累组织中尤为突出，密集排列的细胞和多样的细胞核形态使精确描绘变得复杂。因此，此类组织为评估组织病理学中的分割方法提供了严格的基准。 深度学习（DL）领域的最新进展，特别是基于卷积神经网络（CNNs）的方法，已显著改善了生物医学成像应用中的自动化细胞核分割性能。然而，大多数研究集中于通过荧光显微镜或相对简单的成像环境获得的图像，在这些环境中对比度高且细胞结构更易分离。相比之下，使用明场显微镜对组织学组织切片中的细胞核进行分割仍然具有挑战性，原因在于复杂的组织结构以及标本制备的变异性。 在这些因素中，组织固定和处理可改变细胞形态和组织特征，并可能影响下游图像分析。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）处理仍是组织病理学的金标准。近年来，基于乙二醛固定的快速冷冻样本（CRYO）已被引入作为一种快速替代方案。已有研究表明，乙二醛固定能保持与福尔马林相当的细胞形态和染色特性，同时具有改善结构保存和缩短处理时间等优势。尽管有这些益处，基于乙二醛的CRYO处理用于基于DL的组织学组织分割的适用性，特别是与FFPE处理相比，尚未被系统评估。 在本研究中，研究人员评估了两种成熟的DL架构的性能：StarDist，一种专为描绘单个星凸形物体而设计的实例分割方法；以及DeepLabV3，一种基于空洞卷积和多尺度特征提取的语义分割架构。两种方法均被评估用于对使用常规FFPE和基于乙二醛的CRYO方案制备的苏木精染色淋巴组织进行自动化细胞核分割。该设计使得能够评估组织制备差异是否与互补DL方法的分割性能相关。 本研究的目标是：（1）使用StarDist和DeepLabV3定量评估苏木精染色淋巴组织中的细胞核分割性能，以及（2）评估基于乙二醛的CRYO制备是否提供与常规FFPE处理相当的分割性能。通过使用患者水平验证和独立保留数据评估两种标本制备方案，研究人员旨在评估CRYO制备标本用于基于DL的定量组织病理学分析的可行性。研究结果表明，CRYO制备的标本在数据集中实现了与FFPE制备标本相当的分割性能，支持基于乙二醛的CRYO处理在计算病理学工作流程中的潜在适用性。

论文解读

一、研究背景与意义

淋巴瘤是一类起源于淋巴系统的恶性肿瘤，其诊断和分型高度依赖组织病理学检查。在计算病理学领域，对苏木精染色组织切片中的细胞核进行准确分割是实现定量分析的基础步骤。然而，这一任务面临多重挑战：淋巴组织具有极高的细胞密度、显著的形态异质性，且相邻细胞核之间的对比度较低，这些特征在淋巴瘤受累组织中尤为突出。传统分割方法，如阈值法、分水岭算法和区域生长技术，对染色变异性、图像噪声和细胞重叠现象较为敏感，在复杂组织环境中的应用受到限制。

近年来，基于深度学习（DL）的方法，特别是卷积神经网络（CNNs），已在生物医学图像分割领域取得显著进展。然而，大多数已有研究聚焦于荧光显微镜图像或成像背景相对简单的场景，对于明场显微镜下组织学切片中的细胞核分割，由于组织结构复杂和标本制备的变异性，仍然是一个难题。

在标本制备方面，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）处理是组织病理学的金标准，但其处理周期长，通常需要数天。近年来，基于乙二醛固定的快速冷冻样本（CRYO）方案被引入作为一种快速替代方法，可在2至3小时内完成切片制备。已有研究表明，乙二醛固定能保持与福尔马林相当的细胞形态和染色特性，同时具有改善结构保存和缩短处理时间等优势。然而，基于乙二醛的CRYO处理是否适用于基于DL的组织学图像分割，特别是与FFPE处理相比，尚未得到系统评估。

基于上述背景，研究人员开展了本项研究，旨在比较两种成熟的深度学习架构——StarDist和DeepLabV3——在FFPE和CRYO两种标本制备方案下的细胞核分割性能，以评估CRYO制备标本用于基于DL的定量组织病理学分析的可行性。该研究发表在《Journal of Pathology Informatics》。

二、关键技术方法

研究人员使用了以下主要关键技术方法：

样本队列：研究队列包含18例淋巴结活检标本，来自哈萨克斯坦阿斯塔纳国家肿瘤与移植科学中心，包括10例经典霍奇金淋巴瘤、7例非霍奇金淋巴瘤（含边缘区淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤等亚型）以及1例癌症转移淋巴结标本。每份标本被分为两部分，分别采用FFPE和CRYO方案进行平行组织学处理。

图像采集与标注：使用配备Leica ICC50 HD相机的Leica DM300显微镜，以×40物镜采集图像，空间分辨率为0.16 μm/像素。使用QuPath软件进行人工细胞核标注，最终数据集包含464张图像中84,744个经人工描绘的细胞核，其中FFPE图像231张（45,779个细胞核）、CRYO图像233张（38,965个细胞核）。所有数据划分均在患者水平进行以防止数据泄漏。

StarDist模型：评估了预训练模型（2D_versatile_he）和自定义训练版本。StarDist通过预测目标概率和到目标边界的径向距离来执行实例分割，随后通过非极大值抑制（NMS）解决重叠预测。

DeepLabV3模型：采用基于空洞卷积和空洞空间金字塔池化（ASPP）的语义分割架构，使用ImageNet预训练的EfficientNet-B7编码器，模型总参数量为69.5百万。由于DeepLabV3产生语义前景概率图而非个体实例，研究人员在评估前应用了基于距离变换和标记控制的分水岭算法的后处理程序来提取实例。

评估指标：使用Dice系数、F1分数、Jaccard指数（IoU）、聚合Jaccard指数（AJI）、95百分位Hausdorff距离（HD95）和全景质量（PQ）等指标评估分割性能。

统计方法：采用留一患者法（LOPO）进行交叉验证，使用配对t检验和Wilcoxon符号秩检验进行统计比较，并通过Benjamini-Hochberg程序进行多重检验校正。

三、研究结果

预训练StarDist模型的性能：预训练StarDist模型在FFPE图像上的平均Dice系数为0.7432±0.0374，在CRYO图像上为0.7398±0.0315，两种制备方法之间的差异无统计学意义（配对差值?0.0034，p=0.75）。这表明预训练模型在无需数据集特定微调的情况下，对两种标本制备方法表现出相当的像素级分割性能。

自定义训练StarDist模型的性能：自定义训练的StarDist模型在FFPE图像上的平均Dice系数为0.7354±0.0499，在CRYO图像上为0.7597±0.0506。CRYO比FFPE获得了更高的Dice系数，平均配对差值为0.0243（配对t检验p=0.0641；Wilcoxon符号秩检验p=0.0483）。与预训练模型相比，自定义训练对FFPE图像仅产生小幅下降（?0.0078），而对CRYO图像产生了改善（+0.0199）。

训练集大小对StarDist性能的影响：通过10次重复患者水平划分，以80%、60%、40%和20%的训练比例评估StarDist对训练集大小的敏感性。StarDist在训练集减少时性能保持相对稳定，CRYO图像在各训练比例下变异极小，FFPE图像在训练集减少时Dice系数出现适度下降。在20%训练条件下，StarDist保留了约94%至95%的Dice性能。

DeepLabV3模型的性能：DeepLabV3在FFPE图像上的平均Dice系数为0.8373±0.0370，在CRYO图像上为0.8239±0.0335，两种固定方法之间的差异无统计学意义（配对差值?0.015，p=0.21）。训练收敛分析显示，训练和验证Dice系数在前25个epoch内同步上升，随后逐渐分化，验证Dice稳定在约0.74，表明存在轻度过拟合但无实质性训练不稳定性。

训练集大小对DeepLabV3性能的影响：与StarDist形成鲜明对比，DeepLabV3的性能随训练集减小而显著下降。对于FFPE图像，平均Dice系数从80%训练数据时的约0.82降至20%时的0.34；对于CRYO图像，相应值从约0.83降至0.36。在减少数据条件下，变异也显著增大。DeepLabV3在20%训练条件下仅保留了约41%至43%的完整数据性能。

StarDist与DeepLabV3的比较性能：DeepLabV3在两种固定方法中均获得了比自定义训练的StarDist更高的Dice和Jaccard指数。在患者水平上，DeepLabV3比StarDist的平均Dice系数在FFPE中高0.1020（p<0.0001），在CRYO中高0.0642（p=0.0004）。然而，StarDist在两种标本类型中均显示出更低的HD95值（FFPE为5.25像素，CRYO为6.65像素），表明边界定位更精确。StarDist还获得了更高的PQ值（FFPE为0.576，CRYO为0.613），表明在实例级分割方面表现更佳，而DeepLabV3获得了更高的AJI值。

标本制备方法的统计比较：对三种模型配置（预训练StarDist、自定义训练StarDist和DeepLabV3）进行FFPE与CRYO的配对比较。经Benjamini-Hochberg多重检验校正后，所有比较均未达到统计学显著性（校正后p值分别为0.747、0.192和0.345）。总体而言，三种模型配置中均未观察到FFPE和CRYO之间分割性能的一致差异。

四、讨论与结论

讨论部分指出，DeepLabV3和StarDist展现出互补的优势特征：DeepLabV3在像素级前景分割方面表现优越，这得益于其空洞卷积和ASPP模块能够有效捕获多尺度上下文信息；而StarDist在边界定位、实例级分割和有限训练数据下的稳定性方面更具优势，这归因于其星凸形状先验的有效性。研究还观察到Dice系数（0.75至0.84）与PQ（0.55至0.61）之间存在一致差异，反映了两种指标捕捉分割性能的不同方面，在细胞核密集排列的淋巴组织中，实例级错误可能更为突出。

从工作流程角度看，CRYO制备方案可在2至3小时内完成切片制备，而FFPE需要数天处理时间。CRYO还避免了福尔马林固定，乙二醛固定剂据报道比福尔马林固定剂具有更低的毒性和更低的通风要求。两种标本制备方法之间的分割性能相当，表明基于乙二醛的CRYO处理可提供适合基于DL分割的组织形态。

研究局限性包括：队列规模相对较小，个体淋巴瘤亚型代表性有限；FFPE和CRYO图像来自同一活检标本的不同组织块并独立标注，组织组成差异和标注变异性可能影响结果；所有图像均在单一机构使用相同显微镜和相机系统采集，跨实验室变异性的影响有待评估。

研究结论为：StarDist和DeepLabV3均能对使用FFPE和基于乙二醛的CRYO方案制备的苏木精染色淋巴组织实现准确的细胞核分割。DeepLabV3在像素级和区域级分割准确性方面表现优越，而StarDist在有限训练数据下表现出更强的鲁棒性以及更精确的边界和实例描绘。CRYO标本展现出足够的形态保存，可作为常规FFPE处理的快速替代方案用于定量组织形态学分析。这些发现支持在计算病理学工作流程中结合基于DL的CRYO标本细胞核分割的可行性，但需要在更大规模、多机构的队列中进行验证以确立其普适性。