褪黑素调节实验性精索静脉曲张中的生长停滞与DNA损伤基因GADD153、GADD45g及GADD34

《Cell Biochemistry and Function》：Melatonin Regulates Growth-Arrest and DNA-Damage Genes GADD153, GADD45g and GADD34 in Experimental Varicocele

　　

摘要 本研究旨在揭示实验性精索静脉曲张与褪黑素水平之间的关系。研究使用了40只成年Wistar白化大鼠，并设计了对照组（C）、褪黑素组（M）、精索静脉曲张组（V）及精索静脉曲张+褪黑素组（V+M）。实验第1天通过打开腹腔、以0.85 mm金属丝及4-0丝线缩窄左肾静脉建立精索静脉曲张模型，移除金属丝后以3-0丝线缝合关闭动物，并维持60天。第61天起，以10 mg/kg剂量腹腔注射褪黑素，每24小时给药一次，持续7天。研究进行了组织学分析及GADD34、GADD45g、GADD153免疫组织化学染色，并检测了StAR与GDNF基因表达。同时，从实验动物血清中评估了ABP、FSH、LH、睾酮、褪黑素激素水平以及TAS和TOS水平。研究结果显示，V组睾丸重量、生精小管直径及JTBS评分下降，而GADD34、GADD45g和GADD153蛋白表达升高。V组睾酮和TAS水平下降，TOS水平升高。此外，V组睾酮、FSH、ABP及褪黑素水平降低，LH水平升高，StAR和GDNF基因表达亦下降。在给予褪黑素的V+M组中，生化参数以及组织学、免疫组织化学和基因表达分析均观察到改善。精索静脉曲张期间，内源性褪黑素水平下降，并激活组织内包括GADDs在内的多种机制和激素，导致结构与功能丧失，而褪黑素对精索静脉曲张具有良好的治疗作用。

论文解读：褪黑素对实验性精索静脉曲张中GADD基因家族及睾丸功能的调控作用

一、研究背景与意义

精索静脉曲张是生殖医学领域的常见疾病，其本质是阴囊内蔓状静脉丛的异常静脉扩张和/或迂曲。约三分之一的不育男性因精索静脉曲张就诊，其在普通人群中的患病率约为15%，被认为是男性不育最常见的可纠正病因。尽管手术矫正被视为可逆性治疗手段，但由于其对男性生殖系统的多重负面影响及术后复发风险，相关治疗策略的优化仍是研究热点。

精索静脉曲张的病理生理机制极为复杂且呈多因素特征，主要包括阴囊高温、睾丸内分泌功能障碍、生精障碍及睾丸功能损伤。静脉反流导致静水压升高，进而引起阴囊温度升高、组织缺氧及毒性代谢物蓄积，诱发氧化应激，表现为活性氧增加和总抗氧化能力下降。这些改变同时影响生精细胞与非生精细胞群体，导致睾丸功能障碍。此外，氧化应激可触发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER-stress），破坏细胞稳态，导致细胞功能与结构完整性受损，甚至引发细胞死亡。生长停滞与DNA损伤诱导基因（growth arrest and DNA damage-inducible gene，GADD）家族，包括GADD153、GADD45g和GADD34，在应激条件下表达上调，参与细胞周期阻滞和凋亡调控。

值得注意的是，内源性褪黑素水平随年龄增长逐渐下降，这可能与精索静脉曲张等年龄相关疾病的发生发展存在关联。然而，关于精索静脉曲张后血褪黑素水平变化的研究尚属空白。因此，本研究旨在通过实验性精索静脉曲张大鼠模型，探讨褪黑素对GADD基因家族、支持细胞-间质细胞功能轴及氧化应激状态的调控作用，为精索静脉曲张的病理机制解析及治疗策略优化提供实验依据。该论文发表于《Cell Biochemistry and Function》。

二、主要技术方法概述

研究人员采用成年雄性Wistar白化大鼠（约10周龄，体重200–300 g，来源于Erciyes大学实验与临床研究中心）建立实验模型，共设四组：对照组（C）、褪黑素组（M）、精索静脉曲张组（V）及精索静脉曲张+褪黑素组（V+M）。精索静脉曲张通过左肾静脉部分缩窄术建立，以0.85 mm金属丝为支撑，4-0丝线结扎缩窄血管，术后维持60天。褪黑素以10 mg/kg剂量腹腔注射，每日一次，持续7天。研究综合运用了以下关键技术手段：组织病理学分析（苏木精-伊红染色、Johnsen睾丸活检评分、生精小管形态计量学）、免疫组织化学染色（GADD153、GADD45g、GADD34、GDNF、StAR）、TUNEL凋亡检测、实时荧光定量PCR（检测GDNF与StAR mRNA表达）以及ELISA生化检测（血清及组织中褪黑素、睾酮、FSH、LH、ABP、TAS、TOS水平）。

三、研究结果

3.1 动物体重与睾丸重量测定

实验开始时各组动物体重无统计学差异，实验结束时各组体重均有所增加。左睾丸重量在各组间无统计学显著差异。

3.2 精液分析结果

与C组和M组相比，V组精子数量显著下降。V+M组精子数量较V组略有回升。C组和M组精子以原位运动和前进运动为主，V组以不动精子和前进运动精子为主，V+M组不动精子数量减少，活动精子及前进运动精子数量增加。

3.3 组织病理学发现

C组和M组生精小管结构规则，生精上皮及管间结缔组织正常，生精小管中央可见精子。V组出现生精上皮脱落、管间结缔组织不规则、坏死性小管（深嗜酸性染色）、水肿性萎缩小管及间质水肿。V+M组生精小管上皮结构大部分得以保留，管间结缔组织较规则，间质水肿较V组明显减轻。半定量评分显示，V组间质水肿、水肿性小管、嗜酸性小管及萎缩性小管数量均显著高于C组和M组，V+M组上述指标较V组有所改善。

3.4 JTBS评分与生精小管测量结果

V组JTBS评分较C组和M组显著降低，V+M组较V组显著升高。V组生精小管直径、生精上皮厚度及生精小管管腔宽度均较C组和M组显著下降。V+M组生精小管直径恢复至与C组和M组相似水平，生精上皮厚度和管腔宽度较V组显著增加。

3.5 GADD153、GADD45g和GADD34免疫反应性结果

三种蛋白主要表达于生精上皮，亦见于精原细胞、精母细胞及间质结缔组织。V组GADD153表达较C组和M组显著升高，V+M组显著下降并恢复至接近C组水平。GADD45g在V组表达升高，其中以GADD45g升高最为显著，V+M组表达显著下降。GADD34在V组表达升高，V+M组较V组略有下降。

3.6 GDNF和StAR免疫组织化学及基因表达结果

V组GDNF基因表达较C组和M组降低，V+M组较V组有所升高但未达统计学显著水平。StAR免疫反应性在V组降低，V+M组恢复至接近C组和M组水平。StAR基因表达在V组较C组和M组降低，V+M组仍呈下降趋势。GDNF免疫反应性在V组部分降低但无统计学意义，V+M组较M组和V组有所升高。

3.7 凋亡发现

TUNEL阳性细胞主要分布于生精小管。V组TUNEL阳性细胞数较C组和M组显著增加，V+M组TUNEL阳性细胞数显著低于V组，恢复至与C组和M组相似水平。

3.8 激素水平评估

V组睾酮水平较C组和M组下降，V+M组睾酮水平回升。FSH在V组下降，V+M组较V组升高。LH在V组升高，V+M组较V组下降。组织ABP水平在V组下降，V+M组较V组升高。上述变化均未达到统计学显著水平。

3.9 总氧化/抗氧化水平评估

V组TOS水平升高，V+M组较V组略有下降。TAS水平在V组较C组和M组下降，V+M组较V组略有回升。

3.10 血液与组织褪黑素水平评估

V组组织及血液褪黑素水平均下降。V+M组组织褪黑素水平略有升高，血液褪黑素水平升高至与C组和M组相似水平。

四、讨论与结论

讨论部分指出，精索静脉曲张引起的阴囊温度升高可破坏正常生精过程，导致生精上皮脱落、精子浓度及活动精子数量下降。氧化应激与内质网应激在精索静脉曲张病理过程中发挥核心作用。GADD153（即CHOP）在正常细胞中表达极低，内质网应激诱导凋亡时表达升高；GADD45g参与性别分化及男性不育相关调控；GADD34在DNA损伤及内质网应激条件下被诱导表达。本研究中，GADD45g升高最为显著，可能与其在男性不育中的参与有关。褪黑素可降低三种GADD蛋白的表达，提示其具有抑制内质网应激的作用。此外，精索静脉曲张导致StAR和GDNF mRNA表达下降，反映生精小管及间质结缔组织损伤，而褪黑素对GDNF的调控作用更为明显，提示其可能主要作用于生精小管结构而非间质细胞。激素水平变化（睾酮、FSH、ABP下降，LH升高）进一步证实了支持细胞-间质细胞功能障碍。褪黑素凭借其高脂溶性和水溶性，可有效清除自由基，降低TOS水平并改善TAS水平。

研究结论：褪黑素通过减轻精索静脉曲张后的睾丸损伤、调节氧化/抗氧化系统及激素水平发挥有效保护作用，外源性褪黑素在减轻精索静脉曲张诱导的损伤中具有重要价值。内质网应激后升高的GADD表达在褪黑素存在下显著下降。通过GDNF和StAR评估生精细胞系及非生精细胞功能，揭示褪黑素对支持细胞、生精上皮及间质细胞均具有潜在调控作用。该研究为内源性抗氧化分子在疾病防治中的应用提供了实验基础，未来需延长褪黑素给药时间以获得更具统计学效力的结果。