《Cell Biochemistry and Function》：Microproteins as a Hidden Player in Breast Cancer: From Molecular Insights to Therapeutic Potential
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乳腺癌仍然是全球女性癌症相关死亡的第二大原因，构成一个公共卫生难题。尽管在理解癌症生物学和治疗策略开发方面取得了进展，但由于严重副作用和耐药性限制了治疗效果，治疗反应往往不尽如人意。因此，迫切需要创新方法来改善乳腺癌的诊断、预后和治疗。生物信息学和蛋白质组学的
乳腺癌仍然是全球女性癌症相关死亡的第二大原因，构成一个公共卫生难题。尽管在理解癌症生物学和治疗策略开发方面取得了进展，但由于严重副作用和耐药性限制了治疗效果，治疗反应往往不尽如人意。因此，迫切需要创新方法来改善乳腺癌的诊断、预后和治疗。生物信息学和蛋白质组学的最新进展使得发现了一类由小型开放阅读框（small open reading frames，smORFs）编码的新型小蛋白成为可能，而这些区域此前被认为是不编码蛋白质的。新兴证据表明，这些微小蛋白（microproteins）在调节乳腺癌进展中发挥关键作用。本文回顾了目前对微小蛋白的理解，重点介绍了迄今为止已被确定为乳腺癌关键调控因子的微小蛋白，并探讨了它们在改善乳腺癌管理方面的潜在临床应用。
2 微小蛋白的生物学特性
编码微小蛋白的smORFs可存在于多种基因组环境中，包括先前被认为是非编码区的区域，例如已知蛋白编码基因的5′和3′非翻译区，即上游和下游开放阅读框。此外，smORFs也可来源于主开放阅读框、基因间区和假基因。在线粒体中，smORFs存在于线粒体DNA中。在细胞质内，smORFs散布于各种RNA转录本中，如环状RNA（circRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和pri-microRNA。一些文献也将smORFs称为短开放阅读框（sORFs），通常用于将其与替代开放阅读框（altORFs）区分开来。根据定义，sORFs存在于先前被认为是非编码的转录本（microRNA、lncRNA和circRNA）中，而altORFs则位于与已注释编码基因重叠的区域中。
由smORFs编码的微小蛋白在分子、结构和/或机制层面发挥重要作用，促成多样的细胞和机体功能。许多微小蛋白作为更大蛋白质复合物中的关键亚基发挥作用，它们稳定相互作用或调节活性。例如，哺乳动物线粒体F-ATP酶ε亚基作为一个50-65个氨基酸的亚基，在F0和F1亚复合物中充当组装或稳定因子。一些微小蛋白作为变构调节因子，诱导靶蛋白发生构象变化从而改变其活性。例如，一个31个氨基酸长的微小蛋白肌脂蛋白（sarcolipin，SLN）是肌肉细胞中肌浆/内质网Ca2+-ATP酶（SERCA）泵的调节因子。通过与SERCA 1a的E2构象结合，SLN阻碍SERCA返回其E1构象，从而损害必要的钙摄取。微小蛋白也可以作为信号分子，例如分泌型微小蛋白Apelin，它激活Apelin受体，通过诱导内皮依赖性和一氧化氮依赖性血管舒张来调节心血管稳态。最后，某些微小蛋白自主运作以执行基本任务。例如，HMGN2是一种90个氨基酸的微小蛋白，它与组蛋白H2A-H2B二聚体以及核小体入口和出口位点的DNA相互作用，“锁定”组蛋白核心和DNA。然而，微小蛋白在染色质包装、凝聚以及DNA模板化过程（如转录和复制）调控中的作用仍知之甚少。这种功能多样性使微小蛋白能够充当细胞稳态的精确调节剂，能够影响从DNA修复到能量代谢的各种过程。
3 乳腺癌中的功能性微小蛋白
尽管微小蛋白的功能和潜在机制复杂且尚未完全阐明，但新兴研究已经鉴定出几种与乳腺癌相关的、具有独特表达谱的微小蛋白，包括它们在进展、增殖、迁移和化疗耐药中的作用。研究人员将这些功能性微小蛋白分为乳腺癌促进因子和抑制因子。
3.1 微小蛋白作为肿瘤生长和转移的促进因子
由于快速生长和对新蛋白质的持续需求，癌细胞不可避免地会经历内质网（ER）应激。为了管理重复有丝分裂过程中的ER应激，细胞激活多种修复途径，其中一个关键方面涉及内质网与线粒体之间的通讯。这种串扰发生在线粒体相关内质网膜上，对于调节凋亡、自噬和炎症小体激活至关重要。由LINC00116编码的微小蛋白线粒体调节素（mitoregulin，MTLN）最近被报道不仅控制骨骼肌细胞和脂肪细胞中的线粒体功能，而且还有助于暴露于ER应激的乳腺癌细胞中ER-线粒体相互作用的精确控制。MTLN缺乏会破坏这种通讯，导致负责ER应激反应的基因表达减少。
更常见的是，一些微小蛋白不仅促进癌细胞的生长，还促进其迁移。例如，CAPG-171aa是由环状RNA circCAPG编码的一种微小蛋白。研究发现它在三阴性乳腺癌（TNBC）中高表达，并与晚期临床分期和较差预后密切相关。更重要的是，研究表明CAPG-171aa通过与其靶蛋白相互作用，在肿瘤生长和转移中发挥关键作用。一项体外机制研究表明，这种相互作用阻止了MAP激酶的泛素化和降解，从而导致MAPK/ERK信号通路激活，进一步促进TNBC细胞的增殖和转移扩散。
同样，研究人员首次发现LY6E-DT在乳腺癌组织中编码一个保守的153个氨基酸的蛋白，他们将其命名为“转移相关蛋白”（metastatic-related protein，MRP）。LY6E-DT RNA和蛋白水平在高转移性癌组织中均高于低转移性组织，表明它们积极参与肿瘤转移。后续质谱结果表明MRP主要与hnRNPC相互作用，这是一种调节RNA剪接和加工的RNA结合蛋白。这种相互作用增强了表皮生长因子受体（EGFR）的稳定性和表达，随后激活EGFR信号传导，促进乳腺癌转移。
一种由TRPC5反向链（TRPC5OS）或TRPC5反义RNA 1（TRPC5-AS1）翻译而来的111个氨基酸的微小蛋白TRPC5OS被发现参与乳腺癌的生长和进展。与正常组织相比，在乳腺癌组织中观察到TRPC5OS水平升高。作为一种致癌分子，TRPC5OS过表达不仅在体外促进乳腺癌细胞增殖并加速细胞周期进程，而且在体内异种移植模型中增强肿瘤生长。机制研究表明TRPC5OS与糖酵解途径的成员相互作用，特别是α-烯醇化酶。考虑到增加的葡萄糖代谢对于肿瘤细胞持续无限生长至关重要，TRPC5OS表达与肿瘤大小和分级之间的正相关性突显了其作为预后标志物和治疗靶点的潜力。
此外，一些微小蛋白调节乳腺癌细胞运动性。研究人员发现并鉴定了新的基因CASIMO1，它在Luminal A型乳腺肿瘤中主要过表达。在三株乳腺癌细胞系中敲低CASIMO1破坏了肌动蛋白细胞骨架的组织，导致细胞运动性降低和细胞周期停滞在G0/G1期。此外，发现CASIMO1与角鲨烯环氧化酶（SQLE）相互作用，SQLE是胆固醇合成中的一个关键酶编码基因，也是乳腺癌中已知的癌基因。高水平的CASIMO1有助于SQLE蛋白积累并增加脂滴聚集，以满足癌细胞快速增殖的需求。
癌症干细胞（CSCs）是肿瘤内一个独特的亚群，以其自我更新、产生构成肿瘤的异质性谱系以及在连续移植后长期维持肿瘤的能力为特征。CSCs被广泛认为是肿瘤进展、侵袭、转移、化疗耐药和复发的根本驱动因素。在参与CSC调控的通路中，Wnt/β-catenin信号通路已被确定为维持乳腺癌干细胞（BCSCs）功能的关键贡献者。Tan等人揭示，由lncRNA LINC00511编码的微小蛋白LINC00511-133aa上调干性标志物Oct4、Nanog和SOX2。球体形成实验和Western blot分析进一步支持LINC00511-133aa在激活Wnt/β-catenin通路和促进TNBC细胞系干性中的作用。
除了细胞生长，一些微小蛋白通过增强对传统治疗方法的抵抗力来支持癌细胞。lncRNA人白细胞抗原复合物P5（HCP5）编码一个132个氨基酸的微小蛋白，称为HCP5-132aa。与正常组织相比，该微小蛋白在TNBC细胞系和原发性肿瘤组织中显著上调。HCP5-132aa通过调节铁死亡通路在驱动TNBC恶性程度中发挥关键作用。仅敲低HCP5-132aa的ORF就足以触发铁死亡，表现为ROS水平升高、线粒体嵴减少和膜密度增强。除了在TNBC中的作用外，HCP5-132aa在阿霉素（ADR）耐药的MCF-7/ADR细胞中表达也升高。值得注意的是，沉默HCP5-132aa增加了这些细胞对ADR的敏感性。
3.2 微小蛋白作为肿瘤生长的抑制因子
相比之下，一些微小蛋白抑制癌细胞的生长和/或转移。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是mTOR复合物1（mTORC1）的核心组成部分，通过连接营养信号与代谢过程，作为细胞生长的中枢枢纽。Matsumoto等人的研究揭示了lncRNA LINC00961编码一个功能性微小蛋白，称为氨基酸应答小调节多肽（SPAR）。值得注意的是，SPAR定位于多种细胞类型的溶酶体，它与V-ATP酶相互作用，抑制mTORC1信号活性并抑制肌肉再生。此外，谷氨酰胺是细胞中最丰富的氨基酸之一，也是激活mTOR信号的重要营养物质，从而维持非癌和癌细胞的增殖。在这种背景下，微小蛋白hSPAR通过促进积累的P27KIP1从细胞质转移到溶酶体，从而阻止mTORC1复合物的组装及其相关信号传导，发挥谷氨酰胺抑制剂的作用。重要的是，这些效应似乎对乳腺癌细胞特异。
Wnt/β-catenin通路是癌细胞增殖和分化的关键通路，由于β-catenin的积累和核转位，该通路在TNBC中常常过度活跃。针对这一通路，由lncRNA MIR205HG编码的新型微小蛋白miPEP205已被鉴定并表征为TNBC的肿瘤抑制因子。在机制上，miPEP205增强糖原合酶激酶3β在Tyr216残基上的磷酸化，导致胞质β-catenin降解，进而抑制TNBC组织的恶性进展。使用MMTV-PyMT自发性乳腺癌小鼠模型的临床前验证证实了miPEP205的治疗潜力。遗传引入和直接给予miPEP205均能显著减少原发性肿瘤生长、减弱肺转移并提高荷瘤小鼠的存活率。
LINC00908是首个在TNBC中具有差异表达的编码微小蛋白的lncRNA。随后的研究表明，由此产生的微小蛋白通过其卷曲螺旋结构域与信号转导子和转录激活子3（STAT3）结合，从而减少STAT3磷酸化和血管内皮生长因子（VEGF）的表达。这种微小蛋白被称为STAT3的小调节肽（ASRPS）。在TNBC小鼠模型中，静脉注射ASRPS显著减少了血管生成和肿瘤生长，展示了其作为这种侵袭性乳腺癌亚型抗血管生成治疗药物的前景。
尽管机制尚不明确，一些微小蛋白显示出对乳腺癌转移的抑制作用。MAGI2反义RNA 3（MAGI2-AS3）是一种在乳腺癌中低表达且具有抗肿瘤效应的lncRNA。通过探索其编码潜能，研究人员在MAGI2-AS3中鉴定出五个ORF，其中一个编码名为MAGI2-AS3-ORF5的微小蛋白。维恩图分析揭示了36种与MAGI2-AS3-ORF5相互作用的蛋白质，其中许多与肿瘤大小相关。值得注意的是，其中四种是细胞外基质（ECM）相关蛋白，这表明MAGI2-AS3-ORF5可能通过调节ECM相关通路来影响乳腺癌细胞迁移。
此外，转化生长因子β（TGF-β）通路在乳腺癌中具有复杂作用，可以诱导上皮-间充质转化。研究表明TGF-β处理可以直接影响lncRNA的转录水平。例如，Guo等人鉴定了一个lncRNA LINC00665，它编码一个名为CIP2A-BP的微小蛋白，该蛋白在TNBC小鼠模型中受TGF-β处理而下调。TGF-β激活Smad信号通路，诱导CIP2A-BP从LINC00665的翻译减少。CIP2A-BP的下调与肿瘤侵袭和转移以及较差的总生存期相关。CIP2A-BP通过结合并抑制CIP2A（高达90%的乳腺癌中已知的肿瘤启动子）发挥肿瘤抑制因子的作用。值得注意的是，在MMTV-PyMT小鼠模型中，上调CIP2A-BP或直接给予该微小蛋白均可导致肺转移显著减少并改善生存结果。
3.3 微小蛋白的双向调控作用
值得注意的是，LINC00511-133aa、miPEP205和MAGI2-AS3-ORF5在调节Wnt/β-catenin通路中发挥着相反的作用，这说明同一信号轴可以根据细胞环境被以相反方向利用。LINC00511-133aa激活Wnt/β-catenin信号以促进干性，而miPEP205通过增强GSK-3β介导的胞质β-catenin降解来抑制同一通路，MAGI2-AS3-ORF5则通过在RNA水平上调MAGI2与Wnt/β-catenin抑制相关联。这种双向性并非矛盾，而是反映了Wnt信号在乳腺癌中公认的环境依赖性。LINC00511-133aa在癌症干细胞亚群中运作，在该亚群中Wnt激活是自我更新的生理保守机制；而miPEP205作用于肿瘤主体细胞，在这些细胞中异常的β-catenin核积累驱动不受控制的增殖。因此，β-catenin的亚细胞定位是决定通路结果的关键因素，其胞质降解代表肿瘤抑制事件，而其核转位则驱动干性和增殖靶基因的致癌转录。这些发现共同强调了Wnt/β-catenin通路是乳腺癌中微小蛋白介导调控的一个特别动态的节点，并强调了在特定细胞和分子环境中解读微小蛋白功能的必要性。
4 概念性临床应用与未来展望
正如本文所讨论的，由smORFs编码的微小蛋白通过密切影响关键的细胞过程（如增殖、应激反应、抑制效应、凋亡和迁移）普遍参与肿瘤发生和肿瘤进展。微小蛋白这个新兴领域为乳腺癌管理带来了变革性的希望，例如新型抗肿瘤药物和癌症生物标志物的开发。
4.1 微小蛋白作为治疗的靶点/药物
证据表明，敲低或抑制致癌性微小蛋白有助于减少癌细胞增殖、改善癌症预后，并且还能增强常规抗癌疗法的疗效。鉴于大多数微小蛋白通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）发挥作用，可以开发小分子抑制剂来靶向并破坏这种相互作用。作为适应性最强的治疗方式之一，小分子抑制剂可以通过化学方法进行调控，以实现高效的细胞膜穿透、口服给药和选择性组织分布。然而，许多微小蛋白是通过蛋白质支架或结构作用而非酶活性来发挥其效应的。在这种情况下，蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）可能是另一种选择，通过引入对致癌性微小蛋白的降解来实现。PROTACs是双功能分子，由一个靶蛋白配体连接到一个E3泛素连接酶招募元件组成，形成三元复合物，导致靶向微小蛋白的泛素化和蛋白酶体降解。当然，基于抑制和降解的策略的成功都依赖于几个未解决的挑战。首先，获得相关PPI复合物的高分辨率结构仍然是一个主要瓶颈。此外，确定哪些微小蛋白-PPI轴对癌症进展真正起到限速作用，对于确保有意义的治疗效果至关重要。最后，实现足够的选择性是另一个关键障碍。
或者，调节内源性微小蛋白表达水平作为一种治疗策略引起了越来越多的兴趣，它利用基因和RNA技术来上调肿瘤抑制性微小蛋白或沉默致癌性微小蛋白。这种方法得到了微小蛋白-靶标相互作用固有高特异性的支持，原则上可以将脱靶毒性降至最低。一系列平台可以实现对微小蛋白表达水平的可调控制，包括具有细胞类型特异性启动子的腺相关病毒载体和脂质纳米颗粒。然而，尽管有这些概念上的优势，对内源性微小蛋白表达的间接调节在序列和系统水平上都面临着复杂性。
相比之下，直接给予微小蛋白提供了一种可能更具可控性的策略，因为它完全绕过了转录和转录后调控。在这种模型中，合成或重组微小蛋白被外源递送，直接与其细胞内靶标结合，作为PPIs或信号通路的紧凑、高度特异的调节因子。临床前研究为此方法提供了概念验证：肿瘤抑制性微小蛋白ASRPS的瘤内给药已证明能够通过调节STAT3/VEGF轴抑制血管生成，这在TNBC小鼠模型中显著延长了生存期。尽管如此，直接微小蛋白疗法的转化可行性仍然受到几个相互依赖的药理学和生物物理学限制的制约。由于微小蛋白易受血清、细胞外液和细胞内区室的蛋白水解降解，因此需要高度特异性和生物相容性的递送囊来提高给药后微小蛋白的稳定性和半衰期。另一个不稳定性源于微小蛋白因其较小的分子尺寸而导致的快速清除机制，这使其极易通过肾小球滤过而被快速肾脏清除，从而大大降低了全身生物利用度。此外，外源性给予的微小蛋白存在免疫原性的临床风险。
4.2 微小蛋白作为诊断和预后生物标志物
与健康细胞和组织相比，微小蛋白在乳腺癌中表现出独特的表达模式，这突显了它们在早期检测以及根据预后确定后续治疗方面的潜力。例如，在恶性乳腺癌细胞中高表达的微小蛋白MRP，可以区分有淋巴结转移和无淋巴结转移的患者，表明其作为诊断生物标志物的潜力。此外，已有几项研究将ER应激作为癌症治疗的方法。研究表明，临床上可用的ER应激诱导抗癌药物硼替佐米在MTLN缺陷的乳腺癌细胞中效果增强。因此，MTLN的表达水平可能作为预测对蛋白酶体抑制剂或其他ER应激诱导治疗敏感性的预后生物标志物。某些微小蛋白与肿瘤侵袭性和生存率有关。TNBC特异性微小蛋白ASRPS和HCP5-132aa已被证明与较差的生存率呈正相关，表明它们可作为侵袭性肿瘤行为和治疗反应的指标。
4.3 未来挑战
尽管微小蛋白作为治疗药物具有广阔的临床潜力，但仍有许多挑战必须解决，才能将微小蛋白研究从实验室转化到临床。迄今为止，只有少数乳腺癌特异性微小蛋白被鉴定，而更多蛋白很可能有待发现和验证。然而，由于其体积小且在生物样本中丰度低，检测这些微小蛋白本身仍然具有挑战性。标准蛋白质组学技术要么缺乏必要的灵敏度，要么需要复杂的制备方案才能可靠检测。此外，缺乏良好注释的序列进一步使功能验证复杂化。因此，开发增强的质谱方法和用于注释的生物信息学工具对于克服这些障碍至关重要。同时，开发能够准确反映癌症表型复杂性的稳健测定和模型系统，对于在实验和临床环境中验证微小蛋白功能至关重要。此外，尽管一些微小蛋白已表现出细胞和组织特异性表达模式，但精确定位它们在不同组织中的分布对于确保可靠的样本来源和避免假阳性至关重要。另外，靶向特定的微小蛋白可能会无意中破坏其他细胞过程。全面了解其上游调控机制和下游结合伴侣对于最大限度地减少微小蛋白的脱靶效应是必要的，尤其是在系统性治疗应用中。
5 结论
过去十年转录组学和基因组学的进展改变了我们对非编码RNA（ncRNA）的理解，将它们从“转录噪音”提升为能够编码调节细胞命运和稳态的微小蛋白的潜在功能实体。这一转变揭示了一个涉及包括乳腺癌在内的许多细胞中生理和病理生理过程的新复杂景观。最近的研究已经确定了几个微小蛋白是乳腺癌进展中的关键参与者，影响着肿瘤增殖、迁移和化疗耐药性。这篇综述概述了这些微小蛋白的机制作用，重点介绍了最先进的发现方法，讨论了目前在乳腺癌中已鉴定的功能性微小蛋白，同时也考虑了它们未来临床应用的潜力。尽管有这些有希望的发现，该领域仍处于早期阶段。新型微小蛋白的发现和功能注释正在进行中，特别是对于缺乏可靠临床生物标志物和靶向治疗的TNBC，这导致了以更高核分级为特征的较差预后。
总之，微小蛋白代表了乳腺癌诊断、预后和治疗的一个有前途的前沿。随着先进工具的持续发展，如高通量筛选和改进的递送技术，微小蛋白的生物学功能和调控机制可能很快会被完全理解，从而为个性化乳腺癌管理开启新的策略。
