《European Journal of Human Genetics》：Long-read sequencing reveals a hidden Alu-mediated splice defect in CPLANE1, causing orofaciodigital syndrome type VI
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口面指综合征VI型（OFD VI）是一种隐性遗传性纤毛病，以多发性多指（趾）畸形、臼齿征、唇裂和发育迟缓为特征，由CPLANE1基因的致病变异引起。研究人员报道了一例OFD VI患者，该患者在经过常规遗传学检测（包括短读长全基因组测序（WGS））后仍未能获得遗
口面指综合征VI型（OFD VI）是一种隐性遗传性纤毛病，以多发性多指（趾）畸形、臼齿征、唇裂和发育迟缓为特征，由CPLANE1基因的致病变异引起。研究人员报道了一例OFD VI患者，该患者在经过常规遗传学检测（包括短读长全基因组测序（WGS））后仍未能获得遗传学解释。利用长读长测序，研究人员在CPLANE1基因中发现了两个双等位剪接位点变异，即c.8633-4_8633-3del和一个靠近外显子-内含子边界的Alu元件插入。转录本分析显示，每个变异独立地导致外显子跳跃，定量表达研究显示患者来源成纤维细胞中CPLANE1总mRNA水平降低。基于这些发现，研究人员将c.8633-4_8633-3del变异从意义未明变异（VUS）重新分类为可能致病性变异。短读长WGS漏检的Alu元件插入的鉴定，突显了长读长测序在揭示隐蔽的转座子相关致病变异方面的额外诊断价值。
长读长测序技术（long-read sequencing）正在改变遗传病的诊断格局。下一代测序（NGS）已广泛应用于分子诊断，全外显子测序（WES）能够高效检测蛋白质编码区的致病性变异。全基因组测序（WGS）有望取代染色体分析、array-CGH和WES等多种方法，成为单一诊断工具。然而，短读长测序在解析重复序列和GC富集区域等复杂基因组结构时存在明显不足。长读长测序能够克服这些限制，提高结构变异、重复扩增和表观遗传修饰的检测能力。口面指综合征VI型（OFD VI）是一种常染色体隐性纤毛病，属于Joubert综合征相关疾病，主要致病基因为CPLANE1，该基因编码参与纤毛发生、细胞迁移和Hedgehog信号传导的蛋白质。本研究中，研究人员报道一名在常规短读长WGS后仍无法获得分子诊断的OFD VI患者，通过长读长测序最终发现了两个双等位剪接位点变异，并揭示了Alu元件插入这一隐藏的致病变异类型。该研究发表于《European Journal of Human Genetics》。
研究人员使用PacBio HiFi长读长测序对一例短读长WGS阴性的患者进行了全基因组测序，通过读段分相确定两个变异的双等位基因性质。研究样本来自该患者及其父母，并使用了3名健康对照的成纤维细胞。对患者来源的成纤维细胞提取mRNA，采用Sanger测序分析剪接效应；通过定量PCR（qPCR）检测CPLANE1 mRNA表达水平，并与健康对照比较。变异频率和注释参考了gnomAD v4.1数据库。此外，回顾性检查了短读长WGS数据的BAM文件，以寻找soft-clipped reads作为插入信号的证据。
临床报告（Clinical report）：患者为男性，1.5岁时表现为双手轴后多指、左足多趾、右足多趾并指，伴唇裂和舌形态异常。6岁时随访发现全面发育迟缓（3.5岁独走，6岁仍无语）、肌张力低下、近视和听力障碍。其父系堂表亲亦有并指史，提示家族性多指。这些临床特征符合OFD VI表型谱。
分子遗传学发现（Molecular genetics findings）：短读长WGS未能检出致病性变异，因此患者被纳入长读长测序。PacBio HiFi测序发现两个CPLANE1变异：c.8633-4_8633-3del（NM_001384732.1）和位于外显子14/内含子13边界的Alu元件插入。读段分相显示两者位于不同等位基因，符合隐性遗传模式。c.8633-4_8633-3del在gnomAD v4.1中的等位基因频率为0.00002653，在gnomAD和ClinVar中被归为意义未明变异（VUS）；Alu插入未见于gnomAD，序列分析表明其属于AluYa5家族，并且侧翼存在靶位点重复（TSD），这是逆转录转座子插入的典型标志。基于TSD，该插入位置精确定位于chr5:37,224,330（GRCh38）。
变异的功能评估（Functional assessments of the variants）：由于两个变异均位于内含子且靠近外显子-内含子边界，研究人员通过Sanger测序检测患者成纤维细胞mRNA，发现c.8633-4_8633-3del导致外显子45跳跃，而AluYa5插入导致外显子14跳跃。两个跳跃事件均造成移码（外显子45长81 bp，外显子14长31 bp），预计触发无义介导的mRNA降解（NMD）。定量PCR证实患者CPLANE1 mRNA水平较3个健康对照显著降低，支持双等位基因功能缺失。
短读长WGS数据重分析（Re-analysis of the short-read WGS data）：标准变异调用流程（结构变异和单核苷酸变异）均未检出该Alu插入。但后续检查BAM文件时，在插入位点观察到多个soft-clipped reads，提示插入信号实际上存在，但未被常规流程识别。
在讨论部分，研究人员指出，长读长测序仅基于患者多指表型（HPO: HP:0010442, HP:0010689）即可解析出隐性基因中的第二个命中，而随后6岁时出现的神经发育迟缓使临床诊断为OFD综合征，最终与分子诊断相符。c.8633-4_8633-3del在普通人群中极罕见，其导致外显子45跳跃和移码，依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）标准从VUS重新分类为可能致病性（likely pathogenic）。Alu插入在外显子14/内含子13边界，导致外显子14跳跃和移码，且不存在于人群数据库，根据ACMG标准（PVS1、PM2、PM3）也分类为可能致病性。qPCR结果进一步提供了功能证据。Alu插入未被短读长WGS检出，凸显了该技术在转座子插入检测上的局限。转座元件（TE）约占人类基因组的近50%，AluYa5家族是其中最年轻、最活跃的Alu亚家族，与神经发育障碍和癌症相关。讨论中也推测该Alu插入可能是新生突变，或因短读长测序的检测限制而未出现在人群数据库中。
研究结论可翻译为：总之，随着长读长测序进入临床诊断，本研究展示了其在作图准确性、序列解析和变异分相方面的明确技术优势——无需父母样本或额外的下游分析。此外，长读长测序还提供整合的表观遗传分析，并有可能成为单一、全面的诊断检测手段。更重要的是，长读长测序有望对非编码基因组提供更深入的见解，从而识别以前未被发现的调控变异和疾病机制。
