《Environmental DNA》：Patchy Distribution Patterns of Harmful Algal Bloom Species Along Shandong Coast Uncovered via Metabarcoding Analysis of High-Density Samples
编辑推荐：
山东省拥有漫长的海岸线，众多海湾具有独特的生态属性。海洋经济的快速发展对沿海生态系统产生日益增大的影响，多样化的有害藻华(HAB)频发，威胁着经济的可持续发展以及沿海生态系统的安全和人类健康。然而，这一重要海域中有害藻华物种的组成仍未被充分探索。研究人员利用山
山东省拥有漫长的海岸线，众多海湾具有独特的生态属性。海洋经济的快速发展对沿海生态系统产生日益增大的影响，多样化的有害藻华(HAB)频发，威胁着经济的可持续发展以及沿海生态系统的安全和人类健康。然而，这一重要海域中有害藻华物种的组成仍未被充分探索。研究人员利用山东沿海区域(SCR)的高密度采样和基于18S核糖体DNA V4区的宏条形码技术，结合形态学验证，确定了SCR中有害藻华物种的多样性、相对丰度和地理分布。该研究在SCR中鉴定出95种潜在有害藻华物种，其中40种为在该区域首次发现。该沿海生态系统中HAB物种的分布模式表现出强烈的局部性和斑块性，反映了物种特异性生态位的独特性。例如，关键HAB物种夜光藻(Noctiluca scintillans)在多个不连续的区域被检出。这些结果可作为评估SCR沿海区域HAB物种多样性和分布的基线，也为其他省份沿海区域HAB物种多样性和分布的比较研究提供参考。
**研究背景与科学问题**
山东半岛地处中国东部，毗邻渤海与黄海，拥有长达3345公里的曲折海岸线，分布着众多海湾，为海洋资源开发与利用提供了独特的沿海生态系统。山东是我国重要的海水养殖区，2023年沿海海水养殖面积达617,464公顷，占全国海水养殖面积的29.77%，其中贝类和海藻养殖占据重要地位。此外，该区域还建有海阳核电和石岛湾核电等重要基础设施。因此，山东沿海区域(SCR)海洋生态系统的健康对于区域经济可持续发展至关重要。然而，近年来海洋经济的快速发展给该海域带来了日益增长的生态压力，工业、农业、生活污水排放以及养殖和旅游业开发等人类活动与气候变化相互作用，导致沿海水域富营养化，进而引发多种有害藻华(HAB)事件的频繁发生。HAB事件不仅会因产毒藻类在贝类等水产品中富集毒素而导致养殖减产，还会影响海洋动物健康，甚至堵塞核电站冷却系统，造成严重的经济损失和生态风险。
历史上，1952年至2021年间，在SCR共记录到140起主要HAB事件，鉴定出27种潜在致害藻种，其中夜光藻(Noctiluca scintillans)、血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)等为最常见物种。然而，以往的研究大多依赖基于形态学的方法，该方法对小型或形态相似的隐存种的物种鉴定分辨率较低，难以全面准确地反映HAB物种的真实多样性。近年来，高通量DNA测序技术的发展催生了基于分子标记的宏条形码(metabarcoding)分析技术，已被证明能够更加全面地解析浮游植物多样性，并在中国沿海区域的HAB物种鉴定中展现出独特优势。然而，已有关于SCR浮游植物和HAB的研究要么使用低分辨率的形态学鉴定，要么仅限于局部海区，缺乏对整个山东沿海区域HAB物种组成的大规模系统性调查。
**研究内容与结论**
为摸清SCR中有害藻华物种的组成，本研究利用基于18S核糖体DNA(18S rDNA)V4区的宏条形码技术，对2022年5月采集自SCR沿海35个采样站位的环境样品进行了系统分析。这是迄今为止对该生态和经济上重要区域最全面的HAB物种调查，揭示了关键HAB物种的精细生物地理分布格局。研究共获得16,590个扩增子序列变异体(ASV)，经筛选和注释后，3606个ASV被鉴定为代表浮游植物。研究发现甲藻门(Dinoflagellata)在分子多样性和相对丰度上均占绝对优势。在物种层面，共鉴定出95种潜在HAB物种，其中40种为SCR新记录种。HAB物种的分布呈现明显的局部斑块状模式，而非均匀连续分布，反映了物种特异性生态位的独特性。例如，关键HAB物种N. scintillans在多个不连续区域均有检出，且表现出较高的分子多样性，这可能源于单个细胞内的基因组内变异(IGVs)。冗余分析(RDA)表明，温度是影响浮游植物群落组成的最重要环境因子，NO??–N、叶绿素a等也与HAB物种的分布显著相关。养殖区和河口区因营养盐富集而支持更高的HAB多样性和丰度。通过比较形态学鉴定和宏条形码分析结果，研究发现两者在群落组成上存在显著差异，宏条形码得出的分子相对丰度并不能直接等同于细胞丰度。研究还指出，18S rDNA V4分子标记在物种分辨率上存在局限，且参考数据库的覆盖度不足，未来需要结合多标记基因、完善参考数据库并深入研究IGV的性质，以提高宏条形码分析的准确性。
**研究意义**
该研究首次提供了SCR沿海区域HAB物种组成与分布的全面宏条形码基线数据，为该区域及其他省份沿海HAB物种多样性比较和生态监测提供了重要的科学依据。该成果发表在期刊《Environmental DNA》上。
**主要技术方法**
研究人员于2022年5月搭乘“创新2”号科考船，在山东沿海35个采样站位采集了不同水层的海水样品和网采样品。海水样品经200μm筛绢预过滤后收集于0.22μm聚碳酸酯膜上，网采样品则用于宏条形码分析和形态学观察。环境因子包括温度、盐度、五种营养盐(硝酸氮、亚硝酸氮、氨氮、磷酸盐、硅酸盐)和分级叶绿素a浓度。DNA提取后，对18S rDNA V4区进行PCR扩增，采用Illumina NovaSeq平台进行高通量测序。生物信息学分析使用DADA2流程处理测序数据，并利用PR2数据库和NCBI NT数据库进行物种注释，通过AlgaeBase数据库进行核对。生态学统计分析运用R语言vegan包进行α多样性指数计算和冗余分析(RDA)，使用networkD3、ggplot2等包进行可视化，利用Surfer 16软件绘制分布图，POPART软件构建TCS网络。
**研究结果**
**3.1 基于DADA2宏条形码分析的浮游植物多样性**
通过对273个环境样品的测序数据进行DADA2分析，共获得16,590个ASV，按最低测序深度40,096条reads抽平后，经筛选保留7392个ASV，其中3606个被注释为浮游植物。α多样性分析显示，海阳核电区的ED4-2站和扇贝养殖区的ED7-2站浮游植物ASV丰富度较低。在门水平上，甲藻门(Dinoflagellata)ASV的丰富度和相对丰度在所有站点中均最高。
**3.2 浮游植物群落的分类组成与结构**
在门水平上，甲藻门在分子多样性(56.68%)和分子丰度(61.72%)上均占主导地位。在纲水平上，甲藻纲(Dinophyceae)和共甲藻纲(Syndiniophyceae)的ASV数量与丰度均居所有浮游植物纲的首位。在属水平上，仅含单一物种夜光藻(N. scintillans)的Noctiluca属拥有最多的ASV数量(8.46%)，这反映了基因组内变异(IGVs)驱动的分子多样性，而非真实的物种多样性。此外，绿藻门的Bathycoccus属、隐藻门的Teleaulax属和阳隧胞藻门的Leucocryptos属也存在类似现象。全部浮游植物ASV被归入8个门、29个纲、77个目、131个科和213个属。
**3.3 SCR中有害藻华物种的组成与分布**
注释结果显示，3606个浮游植物ASV中，有180个可明确注释到物种水平，对应53种可确认的潜在HAB物种；另有164个ASV因序列分辨率限制同时匹配多个HAB物种(标记为“1Vm”)，据此推断出另外42种可能存在的HAB物种。本研究共鉴定出95种HAB物种，其中17种是SCR以往记录的HAB事件致害种，40种为以往未在SCR报道的新记录种。许多HAB物种在多个不连续区域呈现高相对丰度。N. scintillans的ASV主要在网采样品中检出，在海面水样中则于东营综合养殖区ED9断面、海参养殖区ED10、ED1和ED2断面高度富集。其他如Teleaulax acuta、Ditylum brightwellii、Gyrodinium dominans、Guinardia delicatula、Pseudochattonella verruculosa、A. sanguinea和Lebouridinium glaucum等也分别在特定养殖区或核电区呈现高丰度分布。
**3.4 形态学鉴定与宏条形码分析鉴定浮游植物的比较**
通过对比形态学与宏条形码两种方法在代表性站位(ED9-5和ED7-2)的鉴定结果，发现两者在群落组成上存在显著差异。在ED9-5站，两种方法均显示夜光藻占主导；但在ED7-2站，形态学鉴定以硅藻Guinardia striata和Rhizosolenia属为主，而宏条形码分析则以隐藻门的Teleaulax amphioxeia为主。类似模式在其他多个站点也有出现，表明宏条形码技术能检测到形态学方法易遗漏的微小或隐存浮游植物。
**3.5 代表性HAB物种的分子特性与地理分布**
研究深入解析了四个代表性HAB物种对应属的分子多样性。Noctiluca属获得116个ASV，呈现一个高丰度的显性序列(ASV_8)和115个低丰度非显性序列的结构，显性ASV_8主要分布于莱州湾ED9断面，与N. scintillans参考序列100%一致。Karlodinium属也呈现类似的高分子多样性。Dinophysis属仅获得2个ASV，显性序列ASV_317主要分布于ED10、ED3和ED4断面，但一个ASV同时与8种Dinophysis物种100%一致。Tripos属获得4个ASV，显性序列ASV_900主要分布于SCR南部的ED3和ED4断面，同样一个ASV同时与4种Tripos物种100%一致。这些结果揭示了18S rDNA V4标记在区分同属近缘种方面的分辨率局限。
**3.6 浮游植物多样性与环境因子的相关性**
RDA分析确定了六个显著环境因子(p < 0.001)，相关性排序为：温度、NO??–N、Chl a-micro、Chl a-pico、DIN、NO??–N。温度是影响浮游植物群落组成的最重要驱动因子。不同水深区域(浅水0–10m、中水10–20m、深水>20m)的群落结构存在细微差异。多数HAB物种优势ASV的分布与环境因子无显著相关，但部分物种如Aureococcus anophagefferens、Gyrodinium dominans、Ditylum brightwellii、Thalassiosira gravida和T. mala的ASV分布与温度呈显著负相关；Guinardia striata、Pseudo-nitzschia delicatissima、P. galaxiae、Pseudochattonella verruculosa、Vicicitus globosus、Karenia bicuneiformis、Phalacroma rotundatum和Tripos fusus等的ASV分布与NO??–N和DIN呈显著负相关；而Nephroselmis pyriformis、T. acuta和L. glaucum的ASV分布则与NO??–N和DIN呈显著正相关。
**讨论与结论**
本研究揭示了几点重要发现。首先，宏条形码分析鉴定的ASV数量往往远超实际的物种分类单元数。Noctiluca属116个ASV对应单一物种N. scintillans，这种两个数量级的差距反映了ASV数量与物种数量之间的不匹配，其本质是单个细胞内的基因组内变异(IGVs)而非真实的物种或遗传多样性，若直接将ASV数量解释为物种多样性会造成严重误读。其次，宏条形码分析中的序列相对丰度(reads数)不能直接等同于细胞丰度，目标标记基因在单细胞中的拷贝数差异以及采样方法(网采 vs. 滤膜)的粒径选择性都会导致分子丰度与显微计数结果产生偏差。第三，18S rDNA V4虽因参考数据库最为完备而广泛使用，但其物种分辨率有限，无法区分许多近缘种(如Dinophysis属和Tripos属内的多个物种)，需要结合28S rDNA等更高分辨率的标记，并不断完善参考数据库。本研究建立的SCR有害藻华物种基线数据表明，该区域HAB物种呈现明显的局部斑块状分布，养殖区和河口区因富营养化而成为HAB多样性和丰度的高发区。主要结论包括：(1)共注释到95种潜在HAB物种，其中40种为首次记录；(2)HAB物种表现出与环境异质性(温度、营养盐、叶绿素a)相对应的强烈局部分布偏好；(3)夜光藻、Teleaulax acuta及部分硅藻物种以显著的空间格局主导HAB群落；(4)养殖区和河口区支持更高的HAB多样性和丰度。此外，分析揭示了宏条形码分子多样性估算与形态学细胞浓度之间的差异。为提升宏条形码分析的准确性和效能，应选择适当的分子标记、丰富和完整参考数据库、开展关于IGV性质的深入研究以及量化每个基因组的基因拷贝数水平。
