引言
抗体因其能够以高亲和力和特异性结合来自病原体的抗原，是免疫系统的关键组成部分。除了天然产生的抗体外，制药行业还为治疗和诊断的各种应用开发了新型抗体（Waldmann, 1991, George and Urch, 2010, Carter and Rajpal, 2022）。因此，了解抗体如何与其抗原结合体相互作用至关重要。
抗体与其抗原之间相互作用的亲和力和特异性与互补决定区（CDRs）密切相关，CDRs由六个环组成：轻链上的L1、L2、L3，以及重链上的H1、H2和H3。CDRs在序列上具有高度变异性，并展现出显著的构象多样性，尤其是H3环。事实上，位于结合位点中心的H3环通常比其他CDR环更长、结构更多样（Weitzner et al., 2015, Tsuchiya and Mizuguchi, 2016, Regep et al., 2017），在抗体-抗原相互作用中发挥着关键作用。此外，抗体的未结合态和结合态结构之间通常会观察到不同的CDR构象（Barozet et al., 2018）。
CDRs的结构可塑性对抗体功能很重要，可以通过构象选择和多特异性等机制促进抗原识别（James et al., 2003, Blackler et al., 2022）。亲和力成熟对抗体柔性的影响仍是活跃的研究领域。多项研究报告指出，成熟过程中抗原结合位点会发生刚化，或暗示胚系抗体是优化了构象灵活性的（Babor and Kortemme, 2009, Schmidt et al., 2013, Li et al., 2015），而其他研究表明构象多样性通常得以维持，并且可能对抗体功能仍然重要（Jeliazkov et al., 2018, Burnett et al., 2020, Fernández-Quintero et al., 2019b, Mikolajek et al., 2022）。这种灵活性加上序列变异性，对抗体的结构研究构成了挑战。X射线晶体学是确定高分辨率结构最常用的实验方法，通常只能提供未结合态或结合态的快照，因此往往不足以全面表征CDR环可及的全部构象景观。此外，结构数据可能因实验条件而产生偏差。特别是，表面环可能形成晶体堆积接触，稳定了那些可能不代表溶液中主导集系的构象。这种效应在抗体中已被充分记录，尤其是对于灵活的CDR环，这对抗体结构预测和预测方法的评估具有重要影响（Nishigami et al., 2016, Fernández-Quintero et al., 2019a）。其他实验条件，例如为减轻同步辐射中的辐射损伤而采用的低温，也可能掩盖功能重要的结构波动（Russi et al., 2017）。出于所有这些原因，计算方法成为分析、验证和补充实验数据的宝贵工具。
虽然计算方法原则上可用于从序列预测蛋白质结构，但在抗体的情况下，其准确性和可靠性仍然有限。尽管近年来结构预测方法取得了巨大进展，无论是通用方法（例如Jumper et al., 2021, Chai Discovery team et al., 2024）还是抗体专用技术（例如Ruffolo et al., 2023, Kenlay et al., 2024），CDRs，特别是H3环，仍然难以实现准确的预测建模（Teplyakov et al., 2014, Vishwakarma et al., 2022, Giulini et al., 2025）。因此，实验技术与计算技术的结合是当前研究CDR环结构最合适的途径。
本研究聚焦于利用X射线晶体学确定的实验结构和计算机蛋白质环建模来理解抗FGFR4抗体的H3环的构象特性。X射线晶体学提供了该抗体在不同人源化和成熟条件下的多种结构快照，揭示了H3环的构象变化。随后，应用计算方法来补充实验数据并创建更完整的H3环模型。特别是，将构象采样和多种评分技术相结合，以建模能量景观，从而为H3环的结构特性提供有价值的见解。
使用该策略预测的H3环构象与实验观察到的构象一致。有趣的是，预测建模方法还识别出了另一种构象状态，并通过分子动力学模拟确认了其稳定性。在以下章节中，我们将讨论这种替代构象的存在。
我们还应用了多种最近的基于深度学习的蛋白质/环结构预测方法，主要有两个目标：()评估其预测实验观察到的CDR-H3环构象的能力，以及()确定它们是否能识别我们方法所揭示的额外构象。下面呈现的结果表明，柔性环仍然是这些方法面临的挑战。
Amélie Barozet|Magali Mathieu|David Papin|Béatrice Cameron|Tarik Dabdoubi|Anne Séverac|Paul Ferrari|Thierry Siméon|Marc Bianciotto|Juan Cortés
