C型凝集素Mincle作为人巨细胞病毒脂质包膜的模式识别受体

《European Journal of Immunology》：The C-Type Lectin Mincle Serves as a Pattern Recognition Receptor for the Lipid Envelope of Human Cytomegalovirus

　　

有包膜病毒拥有一层由宿主来源的脂质、糖脂和病毒糖蛋白组成的复杂混合物构成的膜，这些组分在宿主-病毒相互作用中发挥关键作用。病毒糖蛋白可被一系列免疫凝集素识别，从而调节甚至有时颠覆宿主免疫反应以促进免疫逃逸。病毒脂质能否直接与模式识别受体（PRR）相互作用以调节抗病毒免疫反应仍不清楚。在本研究中，研究人员报道了C型凝集素Mincle对人巨细胞病毒（HCMV）病毒包膜的识别。与先前描述的人类凝集素与病毒之间的相互作用不同，Mincle对HCMV的识别以及典型下游信号通路的伴随激活是由整合到病毒包膜中的宿主细胞来源的脂质和糖脂介导的。利用质谱法，研究人员在HCMV病毒包膜中鉴定出多种先前描述的Mincle配体，包括胆固醇和红细胞糖苷脂（globosides）。研究人员证明，Mincle对HCMV病毒颗粒以及纯胆固醇的识别可诱导原代人巨噬细胞产生促炎细胞因子。总之，这些发现表明Mincle对HCMV脂质包膜的识别构成了一种新型模式识别机制，该机制可能适用于其他有包膜病毒。

先天免疫系统是抵御病原体和异常功能细胞的第一道防线，依赖种系编码的模式识别受体（PRRs）检测健康自身中不存在的异常分子特征。抗病毒先天免疫传统上主要由核酸感受驱动，但C型凝集素家族也能通过碳水化合物识别结构域（CRDs）识别病毒糖蛋白，例如树突状细胞特异性ICAM-3抓取非整合素（DC-SIGN）可识别HCMV和人类免疫缺陷病毒（HIV）的高甘露糖N-聚糖。然而，有包膜病毒如HCMV还携带宿主细胞合成并掺入包膜的脂质和糖脂。已有研究显示HCMV可调节宿主脂质代谢，其病毒包膜的脂质组成与宿主细胞显著不同，尤其富含胆固醇和磷脂。这种独特的脂质谱是否可作为病原体相关分子模式（PAMP）被免疫系统直接识别仍属未知。Mincle是一种髓系细胞表达的C型凝集素，最初被鉴定为分枝杆菌糖脂海藻糖二霉菌酸酯（TDM）的受体，其配体库包含糖脂、脂质及蛋白质，且已知胆固醇和胆固醇衍生物可被Mincle识别并激活下游信号。尽管有零星报道提示Mincle与某些病毒存在关联，但其能否通过脂质直接识别病毒包膜并触发抗病毒免疫反应尚未得到系统研究。为此，研究人员开展了本项研究。

研究人员利用密度垫离心和密度梯度离心纯化HCMV病毒颗粒，通过Fc标记重组人Mincle结合实验、HEK-hMincle NF-κB报道细胞系、脂质提取与质谱分析以及原代人巨噬细胞刺激实验，证明Mincle作为PRR直接识别HCMV的脂质包膜，其中胆固醇是重要的激活配体。该识别触发经典下游信号通路，诱导原代人巨噬细胞产生促炎细胞因子IL-₆和TNF-α。这一发现揭示了一种由病毒脂质直接介导的新型先天免疫识别机制，并可能适用于其他有包膜病毒。论文发表在《European Journal of Immunology》。

主要关键技术方法包括：采用碘克沙醇密度垫离心和密度梯度离心纯化HCMV病毒颗粒，通过纳米流式细胞术（nFC）和透射电镜（TEM）进行表征；利用hMincle-Fc融合蛋白进行结合实验，并使用HEK-hMincle NF-κB报道细胞系检测信号激活；通过Folch法提取病毒总脂质，经反相C₁₈色谱分离和高性能薄层色谱（HPTLC）分析；采用电喷雾电离质谱（ESI-MS）及碰撞诱导解离串联质谱（CID-MS/MS）鉴定脂质成分；用甲基-β-环糊精（MβCD）去除包膜胆固醇；使用人单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）进行功能验证，以ELISA检测细胞因子。样本来源：从剑桥生物科学获得的白膜层（buffy coats）中分离外周血单个核细胞（PBMCs）并分化为MDMs。

**2.1 Human Mincle Interacts With HCMV**

通过hMincle-Fc与纯化HCMV病毒颗粒的结合实验，发现Mincle与病毒颗粒结合，而不与mock对照结合；密度梯度纯化后，结合信号集中于病毒颗粒浓度最高的级分。EDTA完全消除结合，甘露糖仅部分抑制。HEK-hMincle报道细胞可被病毒颗粒激活，而对照细胞无激活。eGFP-HCMV感染实验显示HEK-hMincle细胞感染率（6.0%）显著高于HEK-Null对照（1.8%）。这些结果表明Mincle能够识别HCMV并启动下游信号。

**2.2 Mincle Binding and Activation by HCMV Is Mediated by the Lipid Envelope**

采用Folch法将病毒颗粒分离为有机相和水相后，hMincle-Fc仅与有机相结合，且有机相能激活HEK-hMincle报道细胞；水相无此活性。C₁₈反相色谱进一步分级后，结合活性主要出现在最疏水的两个级分。这证明Mincle的配体定位于病毒脂质包膜。

**2.3 The HCMV Viral Envelope Contains Multiple (Glyco)lipid Ligands of Mincle**

ESI-MS分析各脂质级分，在氯仿级分中鉴定出胆固醇（m/z 369.4）和胆固醇硫酸酯（m/z 465.3）；在甲醇级分中鉴定出globotriose、isoglobotetraose（含神经酰胺536）以及神经节苷脂GM₃、GM₂（含神经酰胺536或646）和岩藻糖基化GM₂。这些均为先前已描述的Mincle配体。因此，HCMV包膜含有多种Mincle脂质/糖脂配体。

**2.4 Both Cholesterol and Glycolipids Are Mincle-Activating Ligands in the HCMV Lipid Envelope**

纯配体结合实验显示，hMincle-Fc与胆固醇结合，胆固醇硫酸酯结合未达统计显著；激活实验中，胆固醇以剂量依赖方式激活HEK-hMincle细胞，EC₅₀为3.6 nM，最大激活水平约为TDB的一半；胆固醇硫酸酯在1 μg/mL时无激活；神经节苷脂GM₁、GM₂和GM₃均不结合也不激活。用MβCD处理病毒颗粒以部分提取胆固醇后，hMincle-Fc结合及报道细胞激活仅部分降低。这说明胆固醇部分介导Mincle激活，病毒包膜中还存在其他糖脂配体参与。

**2.5 Mincle Mediates an Inflammatory Response to HCMV in Human Primary Macrophages**

将IFN-γ预刺激的人MDMs与TDM、胆固醇或HCMV病毒颗粒共孵育，可诱导TNF-α和IL-₆产生；加入Mincle中和抗体后，两种细胞因子的产生几乎完全被消除，而同型对照抗体无此效果。这证实Mincle识别HCMV可直接触发原代人巨噬细胞的促炎反应。

讨论部分指出，该研究首次证明C型凝集素直接识别病毒脂质包膜。Mincle与HCMV的结合可被EDTA完全抑制而被甘露糖仅部分抑制，提示同时存在糖基依赖和非糖基依赖的配体。质谱分析首次在病毒-凝集素相互作用背景下进行了脂质组学鉴定。胆固醇是明确的激活配体，而胆固醇硫酸酯因测试浓度低于其最小激活浓度而未激活；神经节苷脂未检测到结合可能是由于方法灵敏度差异或多价呈递方式不同。La Crosse病毒和MERS-CoV可能通过类似机制被Mincle识别，而SARS-CoV-2因包膜胆固醇含量低，仅通过细胞死亡间接激活Mincle。研究人员还提出，病毒包膜脂质的相对丰度、组成以及脂质双层的可及性是影响Mincle识别的重要因素。HCMV包膜胆固醇富集，而宿主细胞膜脂质比例不同，这或可解释为何病毒颗粒而非宿主细胞能激活Mincle。此外，病毒包膜中的神经节苷脂等其他脂质可能被siglecs、galectins等受体识别，从而参与免疫调节或免疫逃逸。

研究结论为：总之，研究结果表明，Mincle能够识别HCMV脂质包膜，作为一种独特的模式识别机制，揭示了HCMV病毒包膜的免疫调节作用。这些发现值得进一步研究Mincle与其他有包膜病毒之间的潜在相互作用，并应推动对病毒掺入脂质组成及其对先天免疫反应机制贡献的新研究。