IGF2敲除降低但并未消除骨肉瘤的体外与体内生长

《FEBS Open Bio》：IGF2 knockout reduces but does not abolish osteosarcoma growth in vitro and in vivo

　　

胰岛素样生长因子2（IGF2）与骨肉瘤相关，但缺乏其功能的直接证据。本研究使用CRISPR-Cas9在Saos2骨肉瘤细胞中敲除IGF2。敲除细胞在体外表现出增殖降低，且外源性IGF2可完全恢复其增殖。在体内，敲除异种移植瘤的体积仅达野生型肿瘤体积的约25%。此外，转录组学分析显示血管生成相关基因耗竭，但IGF2通路组分无显著变化。最后，尽管与受体依赖性数据的整合提示存在替代信号通路，IGF2缺失在功能上仍具限制性。上述发现表明，IGF2促进骨肉瘤增殖与肿瘤生长，但并非生存所严格必需。

论文解读：IGF2敲除降低但并未消除骨肉瘤的体外与体内生长

一、研究背景与问题

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，尽管采用积极的多模式治疗，仍存在显著的复发和化疗耐药风险。胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor, IGF）轴，特别是胰岛素样生长因子2（IGF2）及其受体IGF1R和IGF2R，被认为是多种癌症治疗耐药的重要机制之一。IGF2通过结合IGF1R和IGF2R调控下游信号通路，包括PI3K/AKT、MAPK和mTOR，这些通路促进细胞存活、增殖和生长。在骨肉瘤中，IGF信号通路基因的突变、IGF1R拷贝数变异及其表达增加均与肿瘤进展相关，IGF2还可保护骨肉瘤细胞免受化疗损伤。因此，靶向IGF轴被视为骨肉瘤的潜在治疗策略。

然而，关于内源性IGF2在骨肉瘤中的直接功能作用，目前仍缺乏明确证据。既往大多数机制研究依赖于对野生型细胞进行外源性IGF2刺激，未能阐明自分泌与旁分泌IGF2信号通路的相对贡献。CRISPR-Cas9功能缺失筛选（如DepMap）虽能测量细胞自主的遗传依赖性，但难以检测对分泌蛋白（如生长因子）的依赖性，因为在混合群体中邻近细胞可通过反式方式提供这些因子。因此，本研究旨在利用CRISPR-Cas9介导的IGF2敲除Saos2细胞模型，阐明自分泌/细胞内在IGF2对骨肉瘤生长的贡献。

二、主要技术方法

研究人员采用CRISPR-Cas9技术，通过核转染将靶向IGF2基因两个位点的单链引导RNA（sgRNA）以核糖核蛋白复合物形式递送至Saos2骨肉瘤细胞（来源于美国典型培养物保藏中心ATCC, HTB-85），经单细胞克隆获得纯合敲除细胞系。体外增殖实验在不同胎牛血清（FBS）浓度及外源性重组人IGF2刺激条件下进行。体内实验使用NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG）免疫缺陷小鼠（6-8周龄雌性，购自Jackson Laboratory），每组6只，皮下注射5×10^6个细胞，定期测量肿瘤体积。转录组分析采用3′端RNA测序（Illumina平台），数据经STAR比对、UMI去重和TMM标准化后，利用单样本基因集富集分析（ssGSEA）进行功能富集。此外，整合了癌症细胞系百科全书（CCLE）和DepMap数据库的基因表达与依赖性数据，并利用CellPhoneDB数据库鉴定生长因子-受体配对。

三、研究结果

1. CRISPR-Cas9介导的IGF2敲除降低骨肉瘤生长

研究人员设计sgRNA进行CRISPR-Cas9介导的敲除，经单克隆筛选获得三个纯合IGF2敲除（KO）细胞系，携带约306 bp缺失，涵盖CCLE中注释的所有IGF2异构体共有的第一个外显子。PCR和Sanger测序确认基因组编辑正确。体外实验中，IGF2 KO细胞在所有测试的FBS浓度下均表现出比野生型（WT）Saos2细胞更低的增殖率，但仍保持可测量的生长。增加FBS浓度可促进两种基因型的增殖，但无法补偿IGF2缺失。相反，向培养基中添加外源性IGF2可显著增强KO细胞增殖，并基本恢复至WT水平，证明IGF2本身足以挽救增殖缺陷，且其信号通路保持完整。体内实验中，IGF2 KO异种移植瘤生长显著慢于WT肿瘤，所有动物均形成肿瘤。70天后，KO肿瘤体积仅为WT肿瘤的约25%，证实IGF2促进肿瘤生长但并非严格必需。

2. 依赖性与表达分析揭示Saos2细胞的代偿性生存通路

研究人员将基因表达数据与DepMap依赖性评分进行比较。IGF1R显示高依赖性（0.71），而IGF2表达较低（0.80），提示可能存在情境依赖的生存通路或极少量配体输入即可维持信号传导。对其他生长因子-受体对的分析表明，多个因子可能部分替代IGF2功能，包括ITGAV（整合素αV）、LIFR（白血病抑制因子受体）、IL6ST（白细胞介素6信号转导子）和PDGFRA（血小板衍生生长因子受体α）。ITGAV是最关键的受体（依赖性评分0.96），多个可结合ITGAV的配体高表达，包括PLAUR、TNC、FN1、MMP2、THBS1、TGFB1、THY1、LAMC1、FGF1、FGF2和SPP1，提示存在强大的自分泌和/或旁分泌细胞外基质（ECM）信号网络。LIF-LIFR和CLCF1-LIFR/IL6ST轴呈中度必需性（LIFR依赖性0.63，IL6ST依赖性0.58），PDGF信号通路经PDGFC和PDGFB作用于PDGFRA（依赖性0.48）也呈中度必需。受体酪氨酸激酶ALK（依赖性0.29）和AXL（依赖性0.16）以及TGFβ/BMP通路（TGFBR1依赖性0.25，BMPR2依赖性0.21）依赖性较低，提示起支持性而非关键性作用。

3. 差异基因表达分析揭示IGF2缺失后转录变化有限

基于WT与IGF2敲除细胞间所有基因按log2倍数变化排序的列表进行基因集富集分析（GSEA）。结果显示，IGF2 KO细胞中血管生成相关基因集呈协调性耗竭（NES=?1.579；FDR=0.041），提示血管生成程序在转录组水平上的代表性降低。MYC靶标V1和V2基因集呈类似的负富集趋势，但未达统计学显著。未观察到与经典IGF轴信号直接相关的基因集富集变化，也未检测到ITGAV相关基因集的富集，表明ITGAV介导的相互作用可能是预先存在的生存通路，而非IGF2缺失的转录后果。

四、讨论与结论

本研究表明，内源性IGF2在骨肉瘤中主要作为生长增强因子而非必需生存因子。体外实验中，IGF2 KO细胞增殖减慢但保留可测量生长；体内实验中，KO肿瘤虽在所有小鼠中形成，但生长显著减缓，最终体积仅为WT的约25%。外源性IGF2可完全恢复KO细胞增殖，证实表型源于配体缺失而非受体表达或下游信号能力改变。血管生成基因集的负富集提示IGF2可能不仅通过内在增殖促进肿瘤生长，还通过支持血管相关程序发挥作用，这解释了体内效应（75%肿瘤减少）超过体外增殖缺陷的原因。ITGAV-ECM主导轴连同LIFR、IL6ST和PDGFRA的中度贡献，可能在IGF2缺失时维持基础增殖。研究存在一定局限性，包括仅使用单一骨肉瘤细胞系、转录组分析限于mRNA水平、未直接评估肿瘤血管化等。总体而言，研究结果提示内源性IGF2支持骨肉瘤的体外增殖和体内肿瘤扩张，但并非生存或肿瘤起始所严格必需，靶向IGF轴的治疗策略需考虑代偿性通路的潜在影响。该论文发表于《FEBS Open Bio》。