蛋白质O-糖基化塑造淋巴管内皮与淋巴结巨噬细胞群体

《The FASEB Journal》：Protein O-Glycosylation Shapes Lymphatic Endothelia and Lymph Node Macrophage Populations

　　

内皮细胞是最早被鉴定为具有表面糖萼的细胞之一，但其功能仍难以捉摸。糖萼内包含许多糖蛋白，其O-糖基化部分受Cosmc调控。Cosmc是T-合酶（T-synthase）功能活性所必需的关键分子伴侣，T-合酶将半乳糖添加至O-聚糖以启动其延伸。研究人员利用在淋巴管内皮细胞（LEC）中诱导性敲除Cosmc（C1Galt1C1）或唾液酸转移酶St3Gal-1的小鼠模型，发现延伸O-聚糖的缺失伴随着糖蛋白组成的重要变化，包括podoplanin、CD44、Lyve-1和ICAM-1。内皮糖萼的这些变化可被粘附分子（如Siglec-1）感知，并导致淋巴结巨噬细胞群体大小和表型的重大变化。研究人员的发现证明了O-糖基化在调控LEC功能和淋巴结巨噬细胞分化中的关键作用。

蛋白质O-糖基化塑造淋巴管内皮与淋巴结巨噬细胞群体——论文解读

一、研究背景与目的

哺乳动物脉管系统由层级化组织的血液和淋巴管构成，淋巴管腔面衬覆淋巴管内皮细胞（LEC），其表达谱系决定转录因子Prox1，并具有独特的表面糖萼，富含多种糖蛋白，包括淋巴管内皮透明质酸受体-1（Lyve-1）和高度O-糖基化的podoplanin。淋巴结（LN）中的LEC可分为被膜下窦顶壁（cLEC）、底壁（fLEC）和髓窦（mLEC）三个亚群，其中fLEC的糖萼以高密度α2,3-唾液酸化O-聚糖为特征。fLEC和mLEC与窦内巨噬细胞（SSM、MSM）密切相互作用，后者直接暴露于输入淋巴液，负责清除抗原和病原体，并将抗原呈递给淋巴组织中的淋巴细胞。既往研究已证实fLEC是SSM细胞龛的关键组分，但O-聚糖在该细胞龛中的具体功能尚不清楚。O-糖基化延伸受T-合酶（C1Galt1）调控——该酶将半乳糖（Gal）添加至N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）生成核心1 O-聚糖，而Cosmc（C1Galt1C1）是其正确折叠和功能活性所必需的内质网分子伴侣。本研究发表于《The FASEB Journal》，旨在通过条件性敲除Cosmc或唾液酸转移酶St3Gal-1，直接阐明O-聚糖在塑造LEC糖萼分子组成及淋巴结巨噬细胞群体形成与维持中的功能作用。

二、主要技术方法

研究人员利用Prox1-CreERT2小鼠分别与Cosmc^fl/fl（由瑞典Uppsala大学与哈佛医学院提供）或St3gal1^fl/fl小鼠杂交，经他莫昔芬在新生或成年期诱导LEC特异性基因缺失。采用CORA方法结合MALDI-TOF质谱分析O-聚糖谱，并行N-聚糖和糖鞘脂（GSL）质谱分析；运用qRT-PCR、流式细胞术、Western blot（结合PNGase F、唾液酸酶、O-糖苷酶等糖苷酶处理）及免疫荧光染色，系统分析LEC表面分子表达、糖蛋白修饰状态及淋巴结巨噬细胞亚群的数量与表型。

三、研究结果

（一）Cosmc/T-合酶功能缺失导致淋巴结LEC丧失α2,3-唾液酸化O-聚糖

CORA-质谱分析显示，CosmcΔLEC来源的LEC仅表达唾液酸化Tn抗原，不再产生野生型细胞中的单/二唾液酸化核心1 O-聚糖；MAL-II（识别α2,3-唾液酸化聚糖）结合几乎消失，HPA（识别Tn抗原）结合增加，Siglec-1-Fc结合显著降低。N-聚糖和GSL谱未受影响。相比之下，St3gal1ΔLEC仅部分减少唾液酸化O-聚糖，提示其他唾液酸转移酶（如St3Gal-2）具有补偿作用，故后续研究聚焦于CosmcΔLEC小鼠。

（二）Cosmc/T-合酶功能缺失以多种方式影响LEC上主要糖蛋白的丰度

流式和免疫荧光显示，Cosmc缺失导致podoplanin、CD44和Lyve-1显著减少，ICAM-1和VCAM-1轻度增加，CD31无显著变化；qPCR证实转录水平未变，提示为转录后调控机制。Western blot证实CD44减少源于其被蛋白水解为20–25 kDa C端片段；ICAM-1仅含N-聚糖，其蛋白丰度在WT与敲除细胞间无差异。

（三）出生后LEC中Cosmc/T-合酶活性缺失影响淋巴结窦内巨噬细胞群体的形成和表型

新生期诱导Cosmc缺失的小鼠至成年后，LN中CD11b⁺巨噬细胞总数增加30%，髓索巨噬细胞（MCM）数量增加约2倍，而SSM和MSM减少40%–60%；MSM的F4/80、CD80和Ki-67表达升高，SSM和MSM的Siglec-1表达降低，MCM的CX3CR1表达升高。成年期诱导Cosmc缺失则对巨噬细胞数量无显著影响，提示出生后早期是LEC O-聚糖塑造巨噬细胞龛的关键时间窗。

四、讨论与结论

讨论指出，二唾液酸化核心1 O-聚糖是小鼠LN LEC上最丰富的O-聚糖类型；Cosmc缺失引起的糖蛋白丰度改变主要影响高度O-糖基化蛋白，机制涉及Tn抗原修饰蛋白的增强蛋白水解和胞外域脱落（如CD44经ADAM10样金属蛋白酶切割）。LEC糖萼的改变可能影响巨噬细胞上多种糖结合蛋白（GBP）对配体的识别，并通过改变CSF-1等信号分子的脱落，而损害SSM和MSM群体由MCM的分化形成。研究结论表明，LEC中T-合酶活性缺失深刻改变细胞糖萼的分子组成；出生后不久诱导的Cosmc缺失导致小鼠淋巴结巨噬细胞群体大小和表型的深刻改变。这些发现确立了T-合酶活性作为LEC细胞表面和分泌组分子组成及其与单核细胞/巨噬细胞相互作用关键调控阀的重要地位，其影响在出生后最初几周单核细胞迁入淋巴结并分化为淋巴窦和髓索特化巨噬细胞群体时最为显著。