《The FASEB Journal》：Insights Into Spatial Transcriptomics: Exploring Recent Technical Developments and Their Diverse Applications
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空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）将空间信息与基因表达数据相结合，在组织和细胞的结构背景下定量检测多种基因的mRNA水平。该领域能够在保留空间定位信息的同时，在转录组水平上同步捕获细胞基因表达，从而增强研究人员对细胞相互作用
空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）将空间信息与基因表达数据相结合，在组织和细胞的结构背景下定量检测多种基因的mRNA水平。该领域能够在保留空间定位信息的同时，在转录组水平上同步捕获细胞基因表达，从而增强研究人员对细胞相互作用及其直接微环境的理解。利用该技术，研究人员可深入解析不同组织区域内的生物发育与疾病机制。近年来，ST技术取得了显著进展，但仍面临对特定样本类型的依赖、可视化基因的分辨率、商业化可行性以及全面单细胞数据采集能力等挑战。本文总结了四种主要的ST技术，通过比较和分析不同的研究方法，以优化实验设计与分析评估；同时强调了ST在整合多组学分析和疾病模型构建中的关键作用，并展望了其未来发展方向。
1 引言
复杂器官组织的精细功能与其组成细胞的空间排列密切相关。然而，传统单细胞测序技术（ScRNA-seq）破坏了细胞原有的空间结构，阻碍了对空间特异性基因表达的理解。相比之下，ST是一种将转录组学与空间信息相结合的新兴技术，可在组织和细胞水平揭示基因表达的模式与空间分布。通过利用先进的高通量技术，ST直接或间接捕获并可视化目标组织内不同空间位置的转录组信息，从而构建基因表达的空间转录图谱。此外，通过将转录数据与组织结构信息整合，该技术能够探索调控基因表达的空间网络，为理解组织功能和疾病机制提供重要见解。
ST的发展不仅依赖于原位测序技术的持续进步，如荧光原位杂交（FISH）和荧光原位测序（FISSEQ），也得益于高通量测序（HTS）技术（又称下一代测序技术，NGS）的发展。这些方法旨在开发定制化核苷酸探针，以捕获组织中的目标转录本，并通过各种测序技术阐明目标基因的空间定位。通过将蛋白质组学、代谢组学等多组学技术与ST整合，可以构建更全面、更精确的基因表达图谱，有助于进一步探索生物系统中基因的功能与调控机制。ST的一个基本特征在于其能够识别目标结构中的空间模式，并揭示这些组织中细胞功能与结构的空间异质性，这凸显了ST在生物研究各领域的巨大潜力。本综述概述了ST技术的发展与进展，并基于文献中具有里程碑意义或代表性的研究对各主题进行讨论。
2 ST技术分类
2.1 基于测序的ST技术
基于测序的ST技术包括两个主要步骤：原位捕获目标mRNA和测序。ST在测序前采用两种不同的mRNA捕获策略：（i）直接显微解剖方法，将计算显微镜与激光显微切割相结合，在保留天然空间组织的同时分离完整的组织区域；（ii）基于条形码的间接方法，采用基因特异性探针同时杂交目标mRNA并通过分子条形码编码空间信息。两种方法随后均通过NGS处理，实现空间解析转录组数据的高通量获取。
2.1.1 利用显微解剖的直接捕获方法
空间显微切割技术的发展遵循从单细胞捕获到系统图谱构建、从静态分析到动态研究、从单一组学到多模态整合的演进逻辑。以转录组体内分析（TIVA）和传统激光捕获显微切割（LCM）为代表的早期技术通过物理分离建立了原位分子分析的基本范式。TIVA能够在活组织内实现非侵入性单细胞转录组捕获，但其通量低且操作复杂。同样，传统LCM虽允许基于形态学进行区域特异性采样，但通量低且因依赖研究者事先选择而引入显著技术偏差。
为克服低通量瓶颈并实现全局分析，RNA断层扫描空间转录组学（tomo-seq）和基因表达综合库测序（Geo-seq）等策略应运而生。这些方法将连续物理切片与高通量测序及计算重建相结合，成功生成器官水平的空间转录组图谱，揭示发育过程中的系统性基因表达模式。然而，其空间分辨率从根本上受限于组织切片厚度，所得图谱最终代表平均化的多细胞信号，无法解析单细胞异质性，且受技术噪声干扰。为基于功能背景而非绝对坐标解析细胞组织，新范式不断涌现。NICHE-seq利用光遗传学工具标记并分析特定功能微环境内的所有细胞，实现按细胞状态和空间邻域进行群体分析。ProximID则通过物理共捕获空间相邻细胞对直接推断相互作用网络。尽管方法不同，两者均代表了从精确坐标映射向揭示空间组织与通讯原理的范式转变，显著拓展了空间生物学的概念框架。
近期发展集中于突破分辨率极限并整合多维信息。光解离化学（PIC）利用空间受限的光化学反应实现亚细胞转录组定位，但其复杂性和有限的捕获区域限制了实际应用。NanoString GeoMx数字空间 profiling（DSP）建立了高多重空间多组学的变革性数字范式，通过光激活条形码释放，在选定组织区域内同步定量分析数百种蛋白质和RNA，大幅提高通量、灵活性和多重分析能力。免疫荧光引导的LCM是一种实用的整合解决方案，通过多色成像预识别目标细胞并引导自动化显微切割，实现从复杂组织样本中高效富集特定细胞群，从而提高后续分子分析的精度和信噪比。
2.1.2 间接空间条形码技术
空间条形码技术利用寡核苷酸标记的载体，通过poly(T)序列特异性捕获不同细胞和组织类型中的poly(A) mRNA，随后进行高通量测序，其效率取决于载体设计对高亲和力结合和高效RNA释放的优化。将空间条形码与微阵列或微流控技术整合，可提高目标转录本与载体的结合通量和效率。当前ST平台主要采用含固定捕获位点阵列的玻璃载玻片或芯片，或磁力排列的微珠来固定mRNA，并通过组织特异性优化透化条件实现mRNA释放。为确定最佳时间，需事先在组织优化载玻片上进行HE染色、明场扫描和荧光检测的比较实验。
空间条形码微阵列测序的演进经历了几个关键技术里程碑：（i）早期系统采用poly(T)功能化玻璃载玻片阵列捕获释放的mRNA，实现原位转录谱分析；（ii）ST平台将基因芯片与NGS整合，生成全面的空间表达图谱；（iii）10× Visium的进步实现了55 μm分辨率和4992个检测点，显著提高通量；（iv）Slide-seq基于橡胶涂层载玻片上的磁珠系统，随后达到10 μm分辨率，接近单细胞精度。Fei Chen及其同事优化了Slide-seq，开发出Slide-seqV2，将mRNA捕获效率提升十倍。Vickovic等人引入高清晰度空间转录组学（HDST），通过改进原位转录本捕获提高通量和分辨率，但微珠捕获特异性仍需改进。Jun Hee Lee等人引入Seq-Scope，利用Illumina高通量测序平台实现0.5–0.8 μm分辨率的亚细胞水平测序。2022年，华大集团推出Stereo-seq，利用滚环扩增形成纳米球阵列芯片，通过条形码poly-dT序列捕获mRNA。随后他们开发了Stereo-CITE-seq，将CITE-seq与Stereo-seq结合，实现超高空间分辨率下全转录组和蛋白质组的同步检测。
与固定阵列平台并行，多种条形码策略应运而生，以应对空间转录组学的特定挑战。耶鲁大学Rong Fan教授团队利用微流控芯片精确递送条形码，形成二维网格状空间阵列，开发了DBiT-seq——一种基于微流控条形码的空间多组学测序技术，可在同一组织切片上以10 μm精度同步获取转录组和蛋白质组的空间分布数据。华盛顿大学的Cole Trapnell和Kelly Stevens开发的sci-Space方法在保持单细胞分辨率的同时解析胚胎尺度的空间异质性，揭示细胞迁移、谱系和位置的时空变化。受膨胀凝胶显微镜启发，斯坦福大学研究人员提出扩展空间转录组学（Ex-ST），通过在mRNA捕获前对组织进行透明化和扩张处理来提高分辨率和捕获效率。2024年1月，10× Genomics正式推出Visium HD，通过在两个6.5×6.5 mm捕获区域内以2×2 μm方格无缝排列数百万个空间条形码寡核苷酸探针，实现连续组织覆盖和单细胞分辨率全转录组检测。APEX-seq技术将抗坏血酸过氧化物酶（APEX）引导至线粒体外膜、核膜等细胞器，利用酶促标记获取活细胞中的时空RNA信息，生成亚细胞分辨率RNA分布图谱。加州大学Matthew F. Krummel教授开发了ZipSeq系统，利用光控打印将DNA条形码沉积到细胞表面而不影响细胞活力，记录空间位置信息供后续单细胞组学数据使用。XYZeq进一步将空间索引与单细胞转录组分析相结合，可同时恢复细胞转录组及其组织内空间来源。
2.2 基于成像的ST技术
基于成像的ST是一种允许在RNA原始位置进行染色和编码的技术，通过原位杂交（ISH）和原位测序（ISS）检测多种RNA分子。ISH是利用成像探针在组织中进行连续杂交的方法，可检测组织或细胞内特定RNA分子及其空间分布。与传统测序方法不同，ISS通过在完整组织内直接扩增和测序RNA实现空间解析转录组分析，同时提供定量基因表达数据和精确位置信息。
2.2.1 基于ISH衍生的ST技术
ISH技术包括放射性ISH和FISH，基于成像的ST主要依赖FISH。FISH由Bauman团队开发，利用荧光探针原位检测特定核酸序列。FISH的核心流程包括探针标记、变性、杂交和荧光可视化，随后通过荧光显微镜定位和定量杂交信号，从而利用光谱不同的探针同时可视化多个靶标。然而，组织样本中的荧光背景会干扰FISH对多种转录本的检测。为解决此问题，Singer团队开发了单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）来识别单个β-肌动蛋白mRNA分子。smFISH使用约20个碱基对的短荧光标记探针匹配特定RNA序列，每个探针结合目标RNA区域产生单一荧光信号，实现精确RNA定量。Eric Lubeck等人引入顺序荧光原位杂交（seqFISH），可在单个酵母细胞中识别12个基因。此外，Eric Lubeck等人还推出了升级版SeqFISH+，利用共聚焦显微镜对小鼠大脑皮层脑室下区和嗅球的单个细胞成像，绘制了2963个细胞中10000个基因的高分辨率mRNA图谱。Adham Safieddine团队开发了高通量测序技术HT-smFISH，利用含有多种寡核苷酸序列的寡聚体库作为模板，经两轮PCR扩增和一次体外转录（IVT）反应生成RNA探针。
除常规FISH衍生策略外， branched DNA原位杂交（bDNA ISH）通过信号放大提高检测灵敏度，无需直接扩增靶标。RollFISH进一步增强了石蜡包埋肿瘤组织中单分子RNA生物标志物的稳健定量。近期，10× Xenium和NanoString CosMx SMI等商业平台将基于成像的空间转录组学推向高度自动化、高多重且临床兼容的工作流程，可在单分子或亚细胞分辨率下检测转录本；CosMx还支持FFPE组织中的RNA-蛋白质共检测。其他代表性ISH方法——包括RNAscope、MERFISH、smHCR、osmFISH和DNA显微镜——分别通过改进信号放大、多重能力、深组织成像和无光学空间推断，进一步拓展了基于成像的空间转录组学方法谱系。
2.2.2 基于ISS衍生的ST技术
另一种基于成像的ST技术是ISS，允许在固定组织或细胞样本中直接测序mRNA。传统测序方法通常需要RNA提取和mRNA分离，丢失样本内的位置信息。ISS则通过在样本切片上直接测序，在细胞和亚细胞水平同时捕获基因表达和空间信息。该领域早期重要进展是荧光原位测序（FISSEQ），无需预先物理分离转录本即可在固定细胞和组织中直接测序RNA。通过结合逆转录、滚环扩增和原位迭代测序，FISSEQ扩展了空间转录本检测范围。Wang Xiao等人开发了空间分辨转录本扩增子读出映射（STARmap），利用水凝胶保持组织切片结构和空间方向，结合组织化学技术使组织透明化，改善细胞内分子可视化。STARmap可靶向小鼠脑组织中超过1000个基因，实现精细的3D基因表达分析。Chen Xiaoying等人引入BaristaSeq以改进ISS的细胞条形码读取。条形码原位靶向测序（BaristaSeq）利用两个寡核苷酸锁式探针在靶DNA上形成环状结构，提高特异性并减少非特异性结合。Shahar Alon团队引入扩展测序（ExSeq），利用膨胀显微镜将生物大分子附着于吸水膨胀的丙烯酰胺凝胶上，物理拉伸细胞结构增加细胞间距，结合FISSEQ进行RNA逆转录和扩增，实现转录组数据与基因组位置的精确关联。
2.3 空间多组学整合方法与框架
空间多组学技术的出现标志着空间生物学从单一转录组图谱向整合的、机制驱动理解的转变。生命系统的空间复杂性由遗传信息（基因组）、动态调控程序（表观基因组）和最终功能执行元件（蛋白质组/代谢组）在多个分子层面的空间组织共同塑造。因此，单一组学维度不足以全面阐明组织功能、细胞命运决定和疾病病理背后的空间逻辑。通过新方法原位整合多样化分子数据，空间多组学技术旨在绘制从基因型和调控潜力到表型表达和功能输出的连续空间通路。
2.3.1 基因组-转录组关系的空间多组学图谱
基因组与转录组的空间整合旨在解决空间生物学的核心问题——将DNA的物理架构与其在完整组织中的转录功能直接关联。Hi-M通过成像染色体构象，在完整生物体中同时捕获基因组结构和转录活性。SABER通过信号放大实现DNA和RNA的多重原位成像，支持增强子-靶基因共定位分析。DNA seqFISH+和OligoFISSEQ等方法提供核基因组组织的高通量成像。原位基因组测序（IGS）直接在完整组织内确定DNA序列和结构，而slide-DNA-seq在组织切片上提供空间解析的DNA测序，将突变和拷贝数变异映射至其组织学背景。
2.3.2 转录组与表观基因组空间架构
与基因组-转录组整合不同，空间表观基因组-转录组整合聚焦于阐明动态可逆的染色质状态——如可及性和特定组蛋白修饰——如何在空间上协调响应发育和微环境信号的转录程序。研究人员开发了两种主要策略实现这一整合。第一种是同步共捕获，以MISAR-seq为代表，利用微流控实现染色质可及性和全转录组的配对组织水平检测，直接揭示空间"染色质开放-基因激活"模块。另一种基于成像的方法是表观基因组MERFISH，将组蛋白修饰的抗体识别与高通量RNA成像相结合，在单细胞中共同可视化活性染色质标记和基因表达。第二种主要策略是独立空间图谱后进行计算关联，Spatial-CUT&Tag和Spatial-ATAC-seq属于此类。此外，spatial ATAC进一步扩展了这一框架，可在组织切片上进行开放染色质的固相捕获和分析。
2.3.3 转录组、蛋白质组与代谢组的空间多模态整合
将转录组与蛋白质组和代谢组整合面临独特的技术挑战，因为蛋白质和代谢物具有固有局限性——无法扩增且常与转录水平呈非线性相关——这推动了专门方法学策略的开发。第一种采用原位多重成像，以MOSAICA、SMI和STARmap PLUS等平台为代表，利用光谱/寿命编码或循环成像在亚细胞分辨率下可视化数百种RNA和蛋白质。第二种策略依赖数字化捕获-释放定量，包括SPOTS和空间CITE-seq等方法，将寡核苷酸标记抗体偶联至选定组织区域内的蛋白质，实现数百种蛋白质与全转录组的高灵敏度并行数字化定量。此外，空间代谢组学分析（SMA）等新兴技术正在开创质谱成像与转录组学的整合，允许小分子代谢物与基因表达模式的直接空间关联。
3 ST在生物研究中的应用
3.1 ST在胚胎发育中的应用
ST可提供基因表达图谱，帮助理解细胞分化和发育的复杂过程。T. Lohoff等人利用seqFISH和10× Genomics Visium空间基因表达技术检测小鼠胚胎组织切片中387个靶基因的mRNA并鉴定351个条形码基因。计算分析辅助选择表达水平低至中等、在细胞类型间高度特异且差异表达的基因，有助于细胞类型判定。心脏标记基因Ttn和Popdc2在心管中高表达，脑标记基因Six3、Lhx2、Otx2和Pou3f1在脑发育中表达水平升高，证实seqFISH和10× Genomics能准确捕获空间和定量基因表达数据。Liu Chang等人利用Stereo-seq技术对斑马鱼胚胎不同发育阶段的15 μm原位矢状冷冻切片进行分析，获得高质量时空转录组数据集，通过选择100个基因验证空间模块，在至少一个切片中检测到95个基因，确认了表征斑马鱼胚胎功能区域或亚区域的空间模块。
3.2 ST在炎症研究中的应用
炎症是免疫系统对外界刺激的防御反应。多种炎症细胞如骨髓来源巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞浸润损伤部位并释放大量炎症介质，形成复杂动态的炎症微环境。ST技术可分析炎症过程的空间特征，构建全面精细的炎症图谱。Anastasia Magoulopoulou等人利用ISS技术检查两株结核分枝杆菌感染小鼠不同时间点的组织切片，阐明肉芽肿病变内炎症巨噬细胞转录本的时间空间分布。Shintaro Seto等人利用LCM技术将C3HeB/FeJ小鼠结核分枝杆菌感染肉芽肿病变分为中央干酪样坏死层、含泡沫巨噬细胞的边缘层和由巨噬细胞及淋巴细胞组成的外周层三个不同区域，整合转录组和蛋白质组分析识别结核病精准治疗的新靶点。Liao Peng等人利用Visium和scRNA-seq等技术综合分析间质性膀胱炎（IC）的细胞和基因组织病理学特征，发现几乎所有免疫亚群高度集中于尿路上皮区域，且这些细胞显著表达纤维化基因（FN1、TGF-β1、COL1A1和COL3A1），提示膀胱结构内存在显著纤维化倾向。Madhav Mantri研究组通过整合单细胞测序和空间RNA测序方法分析呼肠孤病毒感染心脏组织的时空转录组特征，构建病毒性心肌炎高分辨率转录组图谱。Amy R. Cross等人利用GeoMx数字空间 profiler在单细胞分辨率下生成COVID-19感染肺组织损伤部位的空间基因表达数据，反卷积分析显示炎症部位显著免疫激活，以CD8+ T细胞和单核细胞浸润及细胞因子（TLR、IFN、IL-1）升高为特征。Ronja Mothes团队利用10× Visium技术构建COVID-19诱导肺病理纤维化的空间免疫图谱。
3.3 ST在癌症研究中的应用
肿瘤微环境（TME）是肿瘤发展和治疗反应中起关键作用的复杂动态网络。ST利用其空间捕获优势分析不同TME内的组成和空间信息网络。2020年，Andrew L. Ji等人利用scRNA-seq、ST和多重离子束成像（MIBI）对10例人皮肤鳞状细胞癌（cSCC）样本及匹配正常组织进行整合分析，鉴定出cSCC中四个肿瘤亚群，其中一个为癌症特异性肿瘤角质形成细胞（TSK）群体。通过定位TSK的分布和簇邻接模式，发现TSK富集前沿邻近的基质富含内皮细胞和癌症相关成纤维细胞（CAF）相关转录本。Lou Romanens等人利用石蜡包埋组织空间转录组学（ST-FFPE）研究三阴性乳腺癌（TNBC）肿瘤微环境的细胞组成，通过微环境细胞群（MCP）计数器对捕获的TNBC肿瘤组织RNA-seq数据进行反卷积，揭示7例样本中28种免疫细胞的空间分布差异。Wang Yan等人利用10× Visium平台结合多重荧光免疫组化（mfIHC）分析5例浸润性肺腺癌（LUAD）样本，观察到不同细胞类型间的显著空间相关性。Huang Yukai等人利用基因微阵列分析、多重免疫组化（m-IHC）和细胞间空间分析技术（ISAT）研究胃癌中肿瘤相关巨噬细胞的空间异质性，将每个图像分割为肿瘤巢和基质区域提供细胞表型数据。Maxime Meylan等人利用10× Genomics Visium ST免疫组化（IHC）和多重免疫荧光（IF）技术分析130例未治疗透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者的原发肿瘤，揭示具有三级淋巴结构（TLS阳性）的肿瘤在TLS区域内B系和T细胞标记基因表达水平更高。Guo Wei等人利用微阵列10× Visium和scRNA-seq技术分析3例食管鳞状细胞癌（ESCC）患者组织样本，鉴定TME内不同细胞亚群并绘制其在肿瘤和基质区域的分布，揭示转移性与非转移性癌症样本间TME特征的差异。Michael Fatemi等人对4例病理分期T3（pT3）结直肠癌患者组织样本进行研究，开发Inception和GAT模型结合Visium ST技术，利用全切片图像推断ST生物标志物，成功识别多种参与癌症转移、细胞迁移和增殖、糖酵解及上皮-间质转化（EMT）的基因。
4 讨论
尽管ST面临当前挑战，快速的技术进步和广泛应用在推进生命科学理解和阐明疾病机制方面具有巨大潜力。为克服现有局限，研究人员开发了创新策略，包括将组织切片和RNA提取整合到统一微流控芯片系统中实现自动化快速样本处理，以及将超声处理技术与微流控系统和高通量平台耦合以提高制备精度和自动化程度。提高测量精度和可靠性的努力推动了复杂探针设计方法的发展，包括选择高互补性寡核苷酸序列以获得优异杂交特异性、采用化学修饰增强结合亲和力和靶标特异性、整合催化/酶促功能单元实现精确靶标识别和信号放大，以及将新型纳米材料与机器学习和人工智能结合以实现具有卓越灵敏度和精度的探针。为应对数据集有限的问题，研究人员应专注于开发复杂的计算模型和机器学习方法，如生成对抗网络（GANs），从稀疏数据集中提取有意义的生物学见解并生成高保真合成数据。同时必须建立标准化公共存储库以最大化数据可及性并促进合作研究。此外，STRIDE和VT3D等空间检测技术的持续创新对于构建全面的3D器官级转录组图谱和实现基因表达模式的动态可视化至关重要。
随着ST被广泛采用，它将从根本上重塑疾病建模、生物标志物发现和精准医学。在疾病建模中，ST将支持构建从早期炎症到转移扩散的病理过程器官级空间解析图谱，以前所未有的保真度在计算机和离体条件下重现组织结构和细胞邻域。在生物标志物发现领域，ST通过识别仅在天然组织微环境中可检测的空间受限转录程序、配体-受体相互作用热点和稀有细胞状态，克服了群体平均表达谱的局限。在临床精准医学中，将ST整合到诊断工作流程可实现空间引导的患者分层，例如通过绘制免疫排斥与免疫浸润肿瘤区域的分布，或识别空间解析的耐药克隆。最终，将ST与常规组织病理学和新兴AI驱动空间分析工具相结合，可能将病理报告从静态形态学描述转变为直接指导治疗决策的动态空间解析分子图谱。
