同时检测 H5、H7 亚型禽流感病毒及高致病性新城疫病毒三联实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立与应用

《Journal of Virological Methods》：Establishment and Application of a Triplex Real-Time Fluorescent Quantitative RT-PCR Assay for Simultaneous Detection of H5, H7 Subtype AIV and Virulent NDV

　　• 建立了一种三重RT-qPCR检测法，可在同一管中同时检测H5亚型禽流感病毒（H5-AIV）、H7亚型禽流感病毒（H7-AIV）和高致病性新城疫病毒（velogenic NDV），且具有出色的线性关系。• 所开发的方法显示出高度的特异性，对常见的异质性禽类病原体无交叉扩增，并具备优异的同批内/同批间重复性。• 该三重RT-qPCR可实现对低至个位数拷贝水平的靶标模板进行灵敏检测，满足微量病毒核酸鉴定的需求。• 该检测法可准确定量共存感染，共存比范围为1:9至9:1。CT值与靶标丰度成正比。即使在共存感染中含量仅为10%时，仍能被检测到，表明其具有优异的共存感染检测能力。• 与单重RT-qPCR相比，在384份临床样本上验证了高检测一致性，证明了其在现场家禽监测中的实用价值。**引言**禽流感病毒（AIV）属于正黏病毒科甲型流感病毒属，根据表面HA和NA糖蛋白的抗原性差异，被划分为17种HA亚型和9种NA亚型（Wille and Holmes, 2020; Fereidouni et al., 2023; Karakus et al., 2024）。在致病性分类中，AIV被分为低致病性禽流感（LPAIV）和高致病性禽流感（HPAIV），其中H5和H7 HA亚型是全球公认的高风险人畜共患HPAIV毒株，对家禽生产和公共卫生安全构成双重威胁（Lee et al., 2021）。自1959年苏格兰首次记录H5 HPAI疫情以来，H5亚型HPAI在亚洲、欧洲和北美洲反复发生跨边境流行，引发大规模强制扑杀家禽和周期性跨物种感染事件。在中国流行的主要H5亚系（2.3.4.4b、2.3.4.4h）表现出向奶牛、家猫和人类溢出的增强能力（Singh et al., 2024; Rabalski et al., 2023; Chen et al., 2023）。2013年在中国大陆出现的H7N9 LPAIV已导致超过1500例确诊人感染和数百例死亡病例（Li and Chen, 2021; Tan et al., 2021），而来自其他H7变异株（H7N2、H7N3、H7N7）的散发人畜共患事件在世界范围内不断被报告，凸显了H7亚型AIV持续存在的公共卫生危害。此外，H7N9 HPAIV会导致家禽死亡，造成重大经济损失（Yu et al., 2019）。新城疫病毒（NDV）属于副黏病毒科禽病毒属，根据F基因测序结果在系统发育上被分为I类和II类；II类的VI、VII和XII基因型在中国当前占优势于强毒力野毒株，而罕见的VIII/IX强毒力基因型偶尔在散发性家禽疫情中被分离到（Westbury, 2001）。强毒力NDV可引起家禽急性发热性、高度传染性系统性疾病，在未经免疫的鸡群中发病率和死亡率接近100%；职业性人暴露通过接触活禽可能导致单侧结膜炎和轻微上呼吸道不适，使NDV成为另一个关键的被忽视的人畜共患禽类病原体（Ul-Rahman et al., 2022; Zeng et al., 2024）。近几十年来，多重TaqMan实时RT-qPCR已成为在同一管反应中同步鉴别检测多种禽类病原体的分子诊断"金标准"平台，因其不同探针具有可区分的荧光通道，与单靶标PCR检测相比，检测时间缩短、试剂消耗减少（Xie et al., 2014）。多篇已发表文献报道了针对AIV亚型和NDV部分组合的双重/三重qPCR（Zhang et al., 2019; Zhang et al., 2020），但鲜有经验证的三重TaqMan RT-qPCR能够同时覆盖H5-AIV、H7-AIV和强毒力NDV，并具有经ddPCR标定的绝对检测下限以及针对官方国家标准方法的大规模现场样本验证。为填补这一技术空白，本研究设计了三组靶向保守HA（H5/H7-AIV）和F（强毒力NDV）基因组区域的TaqMan引物-探针组合，系统优化了一步法三重RT-qPCR反应参数，并从分析特异性、灵敏度、重复性和临床诊断一致性等方面全面验证了检测性能，旨在建立一种具有成本效益的高通量检测工具，用于H5/H7 HPAI和强毒力新城疫的整合防控与流行病学监测。**章节片段****病毒毒株和参考病原体**特异性面板中使用的所有亚型AIV分离株均由中国国家动物疫病预防控制中心保存和鉴定，依据国家标准、行业标准或实验室方法，包括：A/duck/Fujian/F1226/2025（H1N1，EPI_ISL_20246698，Ct=17.86）、A/chicken/Jiangsu/J2560/2024（H2N4，EPI_ISL_20246665，Ct=23.79）、A/chicken/Jiangsu/NT0308/2023（H3N3，EPI_ISL_19689865，Ct=21.41）、A/duck/Guangxi/X1297/2022（H4N6，EPI_ISL_19731921，Ct=19.92）、A/Gray Goose/Xinjiang/16/2025（H5N1，**优化后的三重RT-qPCR反应体系和循环参数**最终优化的引物/探针工作浓度总结于表2。总20 μL反应体系：4 μL 5×一步法RT-qPCR预混液、优化浓度下相应的正/反向引物和探针、2 μL模板RNA，用无RNase水补足至最终体积20 μL。热循环程序：55 ℃反转录15 min；95 ℃初始预变性30 s；40个扩增循环：95 ℃变性10 s，58 ℃退火与延伸30 s；**讨论**H5/H7 HPAIV和强毒力NDV仍然是全球家禽养殖业中最具经济破坏性和人畜共患风险的禽类病原体，加之AIV HA基因的持续抗原漂移和新兴的新型强毒力NDV变异株，不断挑战现有的常规诊断技术。传统的病毒分离和血清学诊断耗时长、劳动密集，无法满足突发疫情期间的快速现场筛查需求；**结论**通过合理的引物-探针设计和系统的反应优化，成功建立了一种经验证的单管三重TaqMan实时RT-qPCR，可同时对H5-AIV、H7-AIV和强毒力NDV进行特异检测。该新型检测法具有优异的分析特异性、超高灵敏度（个位数拷贝检测下限）、出色的重复性和较高的临床诊断一致性（Kappa值>0.85）。它可广泛应用于常规临床鉴别诊断……**CRediT作者贡献声明**W. J.和H. L.设计了本研究。W. L.、W. L.、S. L.和J. Z.进行了实验。W. L.、C. P.和J. W.分析了数据。W. L.和W. J.撰写了手稿。F. C.、W. J.和H. L.监督了实验并获得了研究经费。所有作者均参与了本文工作并批准了最终手稿。**CRediT作者贡献声明**张锦源（Jingyuan Zhang）：可视化。刘硕（Shuo Liu）：资源。吕文（Wen Lv）：撰写——原稿、可视化。彭程（Cheng Peng）：资源。陈芳芳（Fangfang Chen）：监督。王晶晶（Jingjing Wang）：资源。杨济哲（Jizhe Yang）：资源。刘华雷（Hualei Liu）：监督。蒋文明（Wenming Jiang）：撰写——审阅与编辑、监督。**利益冲突声明**作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。**致谢**本研究由中国国家重点研发计划资助（资助号：2025YFD1800203）。**披露**作者声明不存在利益冲突。吕文 | 张锦源 | 刘硕 | 王晶晶 | 杨济哲 | 彭程 | 陈芳芳 | 刘华雷 | 蒋文明