α-1,3-葡聚糖（α-1,3-glucan）是玉米炭疽病菌（Colletotrichum graminicola）细胞壁完整性及完全毒力所必需的，但并非逃避PAMP（pathogen-associated molecular pattern，病原相关分子模式）触发免疫所必需

《Molecular Microbiology》：α-1,3-Glucan Is Required for Cell Wall Integrity and Full Virulence of Colletotrichum graminicola, but Not for Evasion of PAMP-Triggered Immunity

　　

尽管α-1,3-葡聚糖是丝状植物病原真菌细胞壁中的主要聚合物，但其在营养型和致病型发育中的作用仍知之甚少。玉米炭疽病菌（Colletotrichum graminicola）在叶片表面分化出复杂附着胞（appressorium），并在侵入寄主后表现为半活体营养（hemibiotrophic）生活方式。研究人员对全部三个α-1,3-葡聚糖合酶（AGS）基因（命名为AGS1、AGS2和AGS3）进行启动子-eGFP融合分析，结果表明AGS3在营养型及致病型菌丝中表达，而AGS1和AGS2未检测到或仅极弱表达。靶向基因缺失获得了单缺、双缺及三缺突变体，即完全丧失全部α-1,3-葡聚糖合酶基因。缺乏AGS3的突变体分生孢子产生多条芽管，营养菌丝细胞壁中碱溶性葡萄糖大幅减少，表现超分支、在所有培养基上生长速率下降，并对细胞壁扰动剂Caspofungin和Nikkomycin Z超敏感。此外，缺乏AGS3的突变体毒力严重缺陷，且在体内分化的活体营养菌丝严重畸形。玉米叶片接种这些突变体后细胞细胞壁孔径增大、未带电荷的dextran-FITC偶联物在细胞壁中迁移性增强，且未引发PAMP触发免疫反应，说明α-1,3-葡聚糖并不参与真菌细胞壁掩蔽及免疫逃避，而是控制真菌细胞壁修饰酶的迁移性及细胞壁完整性。

研究背景方面，真菌细胞壁由多糖构成，α-1,3-葡聚糖（α-1,3-glucan）在哺乳动物病原真菌中可形成外层掩蔽β-葡聚糖等PAMP（pathogen-associated molecular pattern，病原相关分子模式），从而逃避免疫识别；但在植物病原真菌中，其作用存在争议：稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）等研究表明其可能具表面屏蔽功能，而玉米炭疽病菌（Colletotrichum graminicola）中β-1,3-葡聚糖合成基因下调以避免PAMP识别，α-1,3-葡聚糖是否参与植物免疫逃避尚不明确。由于丝状植物病原菌与酵母及人病原真菌细胞壁结构不同，研究人员开展本研究以阐明C. graminicola中AGS基因与α-1,3-葡聚糖在营养发育、侵染结构及寄主免疫互作中的功能。该研究发表于《Molecular Microbiology》。

关键技术方法方面，研究人员以C. graminicola野生型CgM2及替代寄主洋葱（Allium cepa）表皮为材料，采用AGS启动子-eGFP（enhanced green fluorescent protein，增强型绿色荧光蛋白）融合可视化表达、靶向缺失构建单/双/三AGS突变体、环境扫描电镜（ESEM）与原子力显微镜（AFM）观察表面形貌、荧光成像与光漂白后荧光恢复（FRAP）分析细胞壁孔径与分子迁移、免疫金标记定位α-1,3-葡聚糖、玉米与洋葱表皮侵染实验，以及RT-qPCR检测玉米PAMP响应基因转录。

研究结果如下。

2.1 α-1,3-葡聚糖是C. graminicola营养菌丝细胞壁功能所必需的。研究人员通过基因组挖掘发现三个AGS基因，启动子-eGFP显示AGS3在营养菌丝强表达。化学组分分析表明三缺突变体碱溶性分数葡萄糖降低、半乳糖升高；生长实验显示缺AGS3及高阶突变体径向生长受损、超分支；ESEM见老菌丝表面皱缩；Caspofungin与Nikkomycin Z处理下三缺突变体更敏感、尖端裂解，说明α-1,3-葡聚糖与几丁质、β-1,3-葡聚糖果共同维持细胞壁功能。

2.2 α-1,3-葡聚糖在营养菌丝细胞壁中均匀分布且存在于菌丝表面。MOPC 104E抗体与DS1-GFP探针标记完整菌丝均发光，超薄切片免疫金标记显示金颗粒跨整层细胞壁而非仅外表层，三缺突变体无标记，证明该聚合物非外表面专属屏蔽层。

2.3 α-1,3-葡聚糖限制细胞壁孔径与分子迁移性。用4、20、70 kDa dextran-FITC实验，野生型仅4 kDa进入，三缺突变体20与70 kDa可入；FRAP显示大分子量探针在三缺中迁移更高；细胞壁可提取蛋白中小分子更多。结论为α-1,3-葡聚糖缩小孔隙、限制细胞壁修饰酶移动。

2.4 α-1,3-葡聚糖是附着胞细胞壁功能所必需的。各突变体附着胞形态似野生型，但缺AGS3者侧生次生附着胞频率高；ESEM与AFM显示三缺突变体表面纤维结构被基质深埋、刚性下降，表明附着胞壁因缺此聚合物而软化。

2.5 Ags3在活体营养侵染结构中产生α-1,3-葡聚糖且为完全毒力所需。非伤口玉米叶上Δags3与三缺几乎无炭疽症状；伤口接种可不经历活体期而症状略恢复。P_AGS3:eGFP在活体菌丝强亮、坏死营养（necrotrophic）菌丝弱亮。洋葱表皮上三缺突变体活体菌丝大叶状严重畸形，且在煮沸灭活宿主中同样畸形，说明非寄主PR蛋白所致，而是真菌自身壁缺陷；少数可由畸形活体菌丝切换出正常坏死菌丝。

2.6 C. graminicola的α-1,3-葡聚糖非逃避玉米叶防御反应所需。36与48 hpi取叶做PAMP响应基因定量，除一个chitinase基因48 hpi略升外，过氧化物酶、xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase、terpene synthase等均未像β-葡聚糖过表达突变体那样数百至千倍诱导。结论为其不具PAMP掩蔽功能。

讨论部分总结为，人病原Histoplasma capsulatum中α-1,3-葡聚糖外层的确掩蔽β-葡聚糖并逃decin-1识别；但丝状植物病原真菌中LysM效应子（如C. higginsianum的ChELP1/2、M. oryzae的Slp1）才物理结合表面几丁质抑制免疫。本文三证据——该聚合物全壁分布、玉米/水稻中缺失仅微弱诱导防御、LysM可接触几丁质——否定了植物病原丝状菌借表面α-1,3-葡聚糖屏蔽PAMP的假说。其真正作用是借减小孔径限制20–60 kDa细胞壁修饰酶（chitinase、endo-β-glucanase、β-1,3-glucanosyltransferase）迁移，导致突变体壁软化、分支/多芽管、附着胞侧萌、活体菌丝自溶畸形。M. oryzae缺ags1在叶面结构裂解亦可用自主壁酶迁移解释。C. graminicola活体期β-1,3-葡聚糖合成下调而AGS3上调，缺α-1,3-葡聚糖后仅靠几丁质不足以维持架构；坏死期AGS3回落、β-1,3-葡聚糖恢复故可长正常坏死菌丝。

研究结论部分原文意译：在C. graminicola中，α-1,3-葡聚糖不参与PAMP掩蔽及植物先天免疫弱化；其结果支持该细胞壁聚合物调控细胞壁内分子迁移性与细胞壁架构，从而解释这一半活体营养玉米病原真菌毒力下降的机制。