《Veterinary Medicine and Science》：Forensic LC–MS/MS Monitoring of Anticoagulant Rodenticide Poisoning in Cats Over a Half-Decade
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摘要
背景：抗凝血灭鼠剂（anticoagulant rodenticides, ARs）是涉及猫疑似中毒的兽医法医调查中的重要毒物。
目的：本研究旨在开发并验证一种标准化的LC–MS/MS-QTRAP方法，用于同时鉴定和定量猫胃基质中的八种抗凝血灭鼠剂，并评
摘要
背景：抗凝血灭鼠剂（anticoagulant rodenticides, ARs）是涉及猫疑似中毒的兽医法医调查中的重要毒物。
目的：本研究旨在开发并验证一种标准化的LC–MS/MS-QTRAP方法，用于同时鉴定和定量猫胃基质中的八种抗凝血灭鼠剂，并评估其在兽医法医毒理学中的适用性。
方法：采用自动化样品前处理以减少分析人员间的差异。应用多重反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）和增强型产物离子（enhanced product ion, EPI）谱图的双重确认，以提高鉴定可靠性并最大程度减少由结构相关化合物引起的假阳性结果。该方法应用于2020年1月至2025年8月期间提交的747例猫法医毒理学病例，其中可获得胃组织或胃内容物进行分析。
结果：在2.5%的病例（19/747）中检测到抗凝血灭鼠剂。杀鼠醚（coumatetralyl）是最常检测到的抗凝血灭鼠剂，其次是氟鼠灵（flocoumafen）和溴敌隆（bromadiolone）。尽管氟鼠灵并非韩国官方注册的活性成分，但仍被检测到，这突显了进行广泛多分析物筛查的必要性。
结论：标准化的LC–MS/MS-QTRAP方法能够可靠地检测和定量猫胃基质中的抗凝血灭鼠剂。该方法为疑似中毒病例中近期抗凝血灭鼠剂暴露提供了有用的法医证据，并可能有助于改善对注册和未注册灭鼠剂的毒物监测。
论文解读：猫抗凝血灭鼠剂中毒的法医LC–MS/MS监测研究
一、研究背景与目的
抗凝血灭鼠剂（anticoagulant rodenticides, ARs）广泛用于农业和城市环境中的啮齿动物种群控制。ARs通过抑制维生素K依赖性凝血因子（II、VII、IX和X）的合成，破坏血液凝固过程，导致内出血，最终引起死亡。根据效价、持久性和毒代动力学特性，ARs分为第一代和第二代化合物。第一代抗凝血剂（如华法林、氯杀鼠灵、杀鼠醚和敌鼠）毒性相对较低、半衰期短，需要反复摄入才能达到致死剂量；而第二代抗凝血剂（如溴敌隆、溴鼠灵、氟鼠灵和硫鼠灵）具有更高的效价和更长的半衰期，单次暴露即可能导致致命中毒。由于在生物系统中的持久性，第二代抗凝血剂对非靶标物种（包括伴侣动物）构成生物蓄积和二次中毒的更大风险。
在临床方面，AR中毒主要表现为出血性疾病，包括黏膜苍白、大面积皮下出血、肺或胃肠出血以及严重内出血。由于暴露往往未被目击且临床症状可能延迟出现，猫的AR中毒诊断具有挑战性。韩国2019至2022年间由动植物检疫局和国立科学调查研究院进行的研究表明，ARs是伴侣动物中毒病例中最常检测到的有毒物质之一。美国动物中毒控制中心（ASPCA）的报告也显示，灭鼠剂是伴侣动物中最常遇到的毒物之一。
然而，在兽医临床环境中，疑似毒物暴露通常通过间接诊断方法评估，这些方法无法鉴定有毒化合物的类型或浓度。因此，迫切需要开发更精确、更系统的分析方法来诊断猫的灭鼠剂中毒。本研究旨在建立并验证一种用于检测猫胃样品中ARs的LC–MS/MS方法，并评估其在兽医法医病例样本中的应用价值。
二、主要技术方法
研究人员开发并验证了一种基于液相色谱-串联质谱-四极杆线性离子阱（LC–MS/MS-QTRAP）的标准化分析方法，用于同时检测和定量猫胃基质中的八种ARs。研究使用了来自韩国动植物检疫局2020年1月至2025年8月期间提交的747例猫法医毒理学病例的胃组织或胃内容物样本。样品前处理采用改良的AOAC QuEChERS方法，结合Biotage Extrahera自动化样品制备系统进行固相萃取净化。质谱分析采用AB SCIEX QTRAP 5500+质谱仪，在负电喷雾电离模式下进行多重反应监测（MRM）采集，并通过信息依赖性采集（IDA）获取增强型产物离子（EPI）谱图进行双重确认。
三、研究结果
3.1 LC–MS/MS方法的优化
研究人员通过注入各灭鼠剂标准溶液，在正负电喷雾电离模式下评估了所有目标化合物。每种化合物通过其保留时间和两个产物离子进行表征。根据2002/657/EC指南，选择最丰富的产物离子作为定量离子，第二产物离子作为定性离子。所有八种目标灭鼠剂在15分钟内实现了良好分离。
3.2 方法验证
方法验证涵盖选择性、线性、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、准确度和精密度。五个空白猫胃组织样本分析未观察到干扰峰。校准曲线在1至100 ng/mL范围内呈良好线性，所有分析物的决定系数（r2）在0.990至0.997之间。LOD范围为0.05–0.1 μg/kg，LOQ范围为0.1–0.5 μg/kg。准确度（以实测浓度与加标浓度之比计算）范围为70.3%至105.6%，符合国际公认的70%–120%标准。精密度以相对标准偏差（RSD）评估，所有分析物的RSD范围为2.4%至8.6%，满足≤15%的接受标准。
3.3 猫AR中毒监测（2020–2025）
在747例送检的法医毒理学病例中，共检测到19例AR阳性病例，总体检出率为2.5%。其中杀鼠醚单独检出14例（73.7%），氟鼠灵单独检出3例（15.8%），杀鼠醚和氟鼠灵同时检出1例（5.3%），溴敌隆单独检出1例（5.3%）。杀鼠醚浓度范围为2.3至107.6 μg/kg（平均值42.6 μg/kg，n=15），氟鼠灵浓度范围为15.9至80.3 μg/kg（平均值43.6 μg/kg，n=4）。阳性病例中，胃组织和胃内容物样本分布相近，分别为52.6%和47.4%。大多数送检来自执法机构（89.5%），尸体主要以冷冻状态提交（89.5%）。出血性发现中，最常见的是鼻周/口周出血（31.6%），其次是广泛性肺出血（21.1%）和肺充血/充血（15.8%）。所有AR阳性样本均通过EPI谱图与参考标准品的比对进行了二次确认，谱图全部匹配，最大程度减少了结构类似物导致假阳性的可能性。
四、讨论与结论
讨论部分总结
本研究所建立的标准化LC–MS/MS-QTRAP分析方法结合自动化固相萃取样品前处理，可在15分钟内同时分离和定量八种ARs。该方法不仅确定暴露，还能在分子水平上快速进行化合物特异性鉴定，从而细化兽医法医对毒物类型和可能的混合暴露的判断。
研究中杀鼠醚的优势检出模式可能部分反映韩国国内灭鼠剂产品的使用情况，韩国灭鼠剂登记主要由国立环境研究院管理，登记制剂主要基于杀鼠醚和溴敌隆。氟鼠灵的检出具有特别意义，因为该化合物在研究期间并非韩国国内登记的活性成分，提示猫可能暴露于未包含在国内登记记录中的产品或来源，这强调了兽医法医检查不应局限于国内登记文件中记载的活性成分，而应支持包含注册和潜在未注册ARs的广泛多分析物筛查。
与既往以肝脏或血液为基质的AR检测研究不同，本研究选择胃组织和胃内容物作为主要分析基质，这对于评估近期口服暴露尤其有价值。胃内容物可能保留死亡时未吸收的AR残留，为近期口服暴露提供补充证据。然而，胃基质无法区分原发性和继发性暴露，也无法确定暴露是意外还是蓄意的。研究中9例AR阳性胃内容物样本在肉眼检查中均未识别出可辨认的灭鼠剂诱饵材料或猎物残骸，因此无法确定暴露途径。
研究人员指出，猫可通过直接摄入灭鼠剂诱饵（原发性暴露）或摄入已消耗AR诱饵的啮齿动物（继发性暴露）而接触ARs。与临床或组织残留研究不同，本研究结果主要支持近期口服暴露，而非长期组织持久性、累积暴露或一般猫群中的暴露流行率。
结论翻译
本研究开发并验证了一种LC–MS/MS-QTRAP方法，用于同时检测和定量猫胃基质中的八种抗凝血灭鼠剂。优化的QuEChERS样品前处理减少了基质相关干扰，为分析法医猫病例的胃组织和胃内容物提供了实用方法。通过将MRM定量与IDA-EPI谱图确认相结合，该方法增强了复杂生物样品中AR鉴定的可信度。15分钟的分析运行时间进一步表明其适用于常规兽医法医毒理学。这些发现表明，猫的胃基质可为AR暴露提供有用的证据，该方法可能有助于改善猫疑似灭鼠剂中毒案件的调查和毒物监测。
