表达诱饵DLL4的溶瘤HSV-1用于高级别胶质瘤的研发及临床前评估

《Oncogene》：Development and preclinical evaluation of a decoy DLL4-encoding oncolytic HSV-1 for high-grade glioma

　　

临床前及临床研究已表明，溶瘤HSV-1（oHSV）治疗肿瘤后可诱导肿瘤内Notch信号增强。由于Notch激活常预示肿瘤细胞干性、血管生成及侵袭能力的增强，oHSV病毒治疗后该通路的诱导可能支持肿瘤生长并限制病毒疗法的疗效。本研究评估了阻断Notch配体DLL4对病毒疗法的影响。对oHSV（CAN-3110，NCT03152318）治疗前后的配对肿瘤活检组织进行分析，发现治疗后DLL4表达被诱导上调。研究人员观察到，表达重组可溶性诱饵DLL4（sDLL4）可阻断肿瘤细胞中的Notch激活。为此，研究人员构建了一种编码可溶性DLL4的溶瘤HSV载体（OVsDLL4），以阻断配体介导的Notch信号。RNA测序及基因集富集分析显示，与对照oHSV相比，OVsDLL4在治疗后阻断了Notch及出芽式血管生成通路。尽管体外病毒复制较慢，OVsDLL4对肿瘤细胞的细胞毒性作用仍然有效。转录组分析还显示，与氧化磷酸化及谷胱甘肽代谢相关的代谢通路显著失调，这与Seahorse分析中sDLL4表达细胞耗氧率增加的结果一致。与对照oHSV处理的细胞相比，OVsDLL4处理的细胞活性氧水平升高。将感染的肿瘤细胞与免疫细胞共培养发现，OVsDLL4处理可将其极化为炎症表型。在体内实验中，OVsDLL4的治疗效果显著，荷瘤胶质瘤小鼠经治疗后肿瘤负荷降低且生存期延长。

论文解读：表达诱饵DLL4的溶瘤HSV-1用于高级别胶质瘤的研发及临床前评估

一、研究背景与问题提出

Notch信号通路是一条在进化上高度保守的细胞间通讯通路，通过相邻细胞表面配体与受体的结合调控细胞命运决定。该通路的激活由JAG1、JAG2、DLL1和DLL4四种激活型配体与四种Notch受体之一结合所启动，并受到抑制性配体DLL3的调控。在肿瘤中，Notch信号通路常被肿瘤干细胞利用，以驱动肿瘤耐药、生长和血管生成。值得注意的是，Notch激活型与抑制型突变均与肿瘤进展相关，提示该通路在肿瘤及基质中的作用高度依赖于具体情境。

既往研究已报道，oHSV治疗胶质瘤后可诱导Notch信号增强，这种激活可招募免疫抑制性髓系细胞，阻碍有效的抗肿瘤免疫应答。因此，将Notch抑制与oHSV治疗相结合被认为是肿瘤治疗的一个有前景的策略。在Notch配体中，JAG1与DLL4在血管生成中发挥相反的作用：DLL4在尖端细胞中的表达激活茎细胞中的Notch1以抑制尖端细胞形成，而JAG1则促进该过程。DLL4高表达与多种实体瘤患者的不良预后相关，其抑制已被提出作为抗癌药物开发的靶点。

然而，在oHSV治疗中特异性阻断DLL4介导的Notch信号尚未被系统研究。本研究旨在评估可溶性诱饵DLL4对oHSV治疗的影响，探索其能否通过阻断配体介导的Notch信号增强病毒疗法的抗肿瘤效果。

二、研究内容与主要结论

研究人员首先分析了oHSV（CAN-3110，NCT03152318）治疗前后复发高级别胶质瘤患者的配对肿瘤活检样本，发现12例患者中有7例在病毒治疗后DLL4基因表达上调。TCGA数据库分析显示，DLL4在多种癌症类型中的表达较正常组织升高。基于此，研究人员构建了稳定表达可溶性DLL4（sDLL4）的胶质瘤细胞系，发现sDLL4可抑制Notch相关基因表达，并在体外和体内减缓肿瘤生长。在颅内原位胶质瘤模型中，携带sDLL4表达肿瘤的小鼠生存期显著延长。

在此基础上，研究人员在RL1缺失的oHSV骨架（OncoD）的UL39-UL40缺失位点中插入人DLL4胞外域编码序列，构建了表达sDLL4的溶瘤病毒OVsDLL4。RNA测序和基因集富集分析显示，与对照OncoD相比，OVsDLL4处理后的肿瘤细胞中Notch信号通路和出芽式血管生成通路均呈负富集。尽管OVsDLL4在体外的病毒复制和传播动力学较OncoD减慢，但其对多种胶质瘤细胞系的细胞毒性作用与对照病毒相当。

转录组分析还显示，OVsDLL4处理显著富集了氧化磷酸化、三羧酸循环、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及谷胱甘肽代谢等代谢通路。Seahorse分析证实sDLL4表达细胞的耗氧率升高，表明线粒体活性增强。与此一致，OVsDLL4处理的肿瘤细胞活性氧水平显著高于对照病毒处理组。

在免疫微环境方面，将感染的肿瘤细胞与巨噬细胞共培养并进行物种特异性RNA测序分析发现，OVsDLL4处理可将巨噬细胞极化为炎症表型，富集单核细胞趋化、细胞黏附和炎症反应激活等相关通路。Boyden小室实验显示巨噬细胞向OVsDLL4处理肿瘤细胞的趋化性增强。Luminex分析表明，OVsDLL4处理的肿瘤细胞与人类PBMC或CD14⁺单核细胞共培养后，TNFα分泌显著增加。在体内治疗实验中，OVsDLL4治疗可显著延长颅内人胶质瘤荷瘤裸鼠的生存期。

三、主要技术方法

本研究采用了以下关键技术方法：利用临床队列样本（CAN-3110临床试验，NCT03152318）的转录组数据评估oHSV治疗前后DLL4表达变化；通过慢病毒转导构建稳定表达sDLL4的胶质瘤细胞系；利用细菌人工染色体（BAC）重组技术构建编码sDLL4的oHSV（OVsDLL4）；采用RNA测序结合基因集富集分析（GSEA）解析转录组变化；通过Seahorse细胞代谢分析测定耗氧率；利用CellROX流式细胞术定量活性氧；通过共培养实验结合物种特异性转录组去卷积分析巨噬细胞极化状态；采用Boyden小室实验评估巨噬细胞趋化；利用Luminex技术检测细胞因子分泌；通过皮下和颅内异种移植瘤模型评估体内抗肿瘤疗效，并采用磁共振成像（MRI）监测肿瘤生长。

四、讨论与结论

本研究表明，DLL4在oHSV治疗后表达上调，提示其可能介导病毒治疗的耐药机制。这是首个报道可溶性DLL4表达可降低肿瘤细胞增殖并抑制oHSV病毒传播的研究。OVsDLL4通过阻断DLL4介导的Notch信号，改变了肿瘤细胞的代谢状态，增加了氧化磷酸化和活性氧水平，并将巨噬细胞极化为炎症抗肿瘤表型。尽管OVsDLL4在体外病毒复制较慢，但其在体内仍表现出增强的抗肿瘤疗效。

研究人员指出，本研究的主要局限性在于未在同基因小鼠模型中评估该病毒疗法的抗肿瘤效果，考虑到DLL4在T细胞发育和功能中具有情境依赖性的免疫调节作用。此外，sDLL4对血管内皮细胞的潜在脱靶Notch阻断效应也值得进一步探索，鉴于DLL4在抗血管生成中的关键作用，OVsDLL4可能对高血管化肿瘤具有抗血管生成的治疗潜力。该研究发表于《Oncogene》，支持了Notch驱动通路具有情境依赖性对立效应的既往观察，并表明通过干扰这些通路可抵消耐药机制、增强oHSV在实体瘤中的治疗疗效。