基于玉米芯衍生活性炭的酪氨酸酶伏安生物传感器用于多巴胺检测

《Journal of Nanotechnology》：Sustainable Tyrosinase-Based Voltammetric Biosensor for Dopamine Detection Using Maize Cob–Derived Activated Carbon

　　

开发了一种高灵敏度且环境友好的基于酪氨酸酶的伏安生物传感器，该传感器采用由玉米芯壳制备的活性炭（MSAC）作为电极修饰材料，用于检测多巴胺（DPM）。X射线衍射（XRD）、场发射扫描电子显微镜（FESEM）、高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）和X射线光电子能谱（XPS）分析证实，通过化学碳化和KOH活化处理生物质所得到的MSAC具有高度多孔的网络结构，表面富含官能团。MSAC的高比表面积及其表面的杂原子促进了酪氨酸酶（TYR）的固定化，并增强了电子转移动力学。由于导电碳基质与酶生物识别之间的协同相互作用效应，合成的TYR–MSAC@GCE在多巴胺氧化过程中表现出优异的电催化性能。差分脉冲伏安法（DPV）的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1.86 μM和6.19 μM，灵敏度为0.0313 μA·μM-1，且在5–100 μM浓度范围内对多巴胺呈线性响应。该生物传感器对常见干扰物质表现出高选择性，具有良好的重现性（相对标准偏差小于5%）、长期稳定运行（30天后信号保持率为93.8%）以及良好的重复性。通过标准加入法在稀释人血清中测定多巴胺，回收率为99.04%–102.6%，验证了所提出传感器的实用性。该研究工作还展示了将农业废弃物基活性炭作为一种可持续的电极材料，用于开发临床和生物医学领域高效酶生物传感器的潜力。

一、研究背景与意义

多巴胺（DPM）是一种关键的儿茶酚胺类神经递质，广泛存在于哺乳动物的中枢神经系统中，调节代谢过程、心血管功能、激素平衡、肾脏活动以及与学习、记忆、注意力等相关的关键脑回路。临床上，DPM用于治疗急性心力衰竭、感染性休克和严重低血压。人体内DPM的正常水平通常在10^-6至10^-9 M之间，其异常波动与严重的神经和行为障碍有关。因此，准确测量DPM及其代谢物对于临床评估和诊断应用至关重要。

传统的DPM检测方法包括比色法、化学发光法、荧光技术以及高效液相色谱（HPLC），但这些方法通常耗时、成本高昂，且需要经验丰富的技术人员。相比之下，电化学方法因其简便、廉价、仪器需求少且灵敏度高而备受关注。然而，非酶电化学传感器在实际样品中常受到抗坏血酸（AA）等干扰物的影响，导致灵敏度显著下降。利用酪氨酸酶（TYR）的生物传感器为解决这一问题提供了可行方案，因为DPM是TYR儿茶酚酶活性的主要底物，而AA不参与该酶促反应。TYR在氧气存在下催化酚类化合物连续氧化为相应的邻醌，后者在电极表面被电化学还原回原始形式，形成生物电催化氧化还原循环，从而增强检测信号并提高选择性。

近年来，碳基材料因其优异的导电性、化学稳定性、生物相容性和高比表面积，作为酶传感器的电极基底受到广泛关注。其中，活性炭（AC）因其多孔结构、可调的表面化学性质和成本效益尤为理想。传统AC原料如煤、石油沥青和合成聚合物不可再生且对环境有害，而来源于生物质的AC则是一种绿色且经济的选择。农业废弃物中的玉米芯因碳含量高、价格低廉且来源丰富而极具吸引力。全球每年有数百万吨玉米芯未被利用，通常被焚烧或任其腐烂造成污染。从玉米芯生产AC符合可持续发展目标和废物资源化应用的理念。

尽管对生物质衍生碳用于电化学传感器的兴趣日益增长，但针对DPM检测的酶生物传感器，特别是基于TYR的器件，研究相对不足。大多数先前的研究集中在非酶电极上，因此在开发可持续、高灵敏度和高选择性的酶传感器方面存在空白。为填补这一空白，研究人员开发了一种基于TYR的伏安生物传感器，利用来自玉米芯壳的活性炭（MSAC）作为高比表面积的可持续电极材料，实现了在真实生物样品中对DPM的快速、灵敏和选择性检测。该论文发表于《Journal of Nanotechnology》。

二、关键技术方法

为开展本研究，研究人员采用了以下主要关键技术方法：

1. 1.
   MSAC的合成：采用三步法制备玉米芯壳活性炭（MSAC）。首先，将收集的玉米芯切碎清洗干燥后，用浓硫酸进行化学碳化；其次，在氮气氛围下于管式炉中加热至800°C进行热解碳化；最后，将碳化产物与KOH按重量比1:5混合，在氮气氛围下于600°C进行化学活化，得到最终的多孔黑色粉末MSAC。
2. 2.
   结构表征技术：使用X射线衍射（XRD）分析晶体结构；利用场发射扫描电子显微镜（FESEM）结合能谱分析观察表面形貌和元素分布；采用高分辨透射电子显微镜（HRTEM）详细检查微观结构；运用X射线光电子能谱（XPS）确定元素组成和化学价态。
3. 3.
   电化学测试方法：采用典型的三电极体系，以修饰的玻碳电极（GCE）为工作电极，铂丝为对电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极。使用电化学阻抗谱（EIS）探测电荷转移行为，通过循环伏安法（CV）研究电化学特性，并采用差分脉冲伏安法（DPV）进行多巴胺的定量检测。
4. 4.
   生物传感器构建：将MSAC悬浮液滴涂到洁净的GCE表面制得MSAC@GCE电极，随后将酪氨酸酶（TYR）溶液滴涂到MSAC@GCE表面进行酶固定化，最后用Nafion覆盖以减少酶泄漏和干扰。用于实际样品测试的人血清购自Sigma-Aldrich公司。

三、研究结果

3.1 XRD研究

通过XRD分析碳化及KOH活化所得碳材料的结构特征。结果显示，活性炭在约24°和42°处出现两个宽衍射峰，分别对应无定形碳的（002）和（100）晶面，表明形成了以无定形为主的碳结构，同时KOH活化在一定程度上提高了碳基体的有序度。

3.2 FESEM和HRTEM分析

FESEM图像显示MSAC具有高度多孔的表面形貌，布满大量发育良好的圆形或椭圆形空腔，有利于提高吸附容量。HRTEM图像清晰揭示了无定形碳骨架中存在大量结构缺陷和高孔隙率纹理，在高放大倍数下可观察到局部石墨化碳层嵌入无定形基质中，证实了材料的部分石墨化特性。

3.3 XPS分析

XPS分析确认MSAC的元素组成以碳为主，表面含有少量氮和氧。高分辨率C 1s谱显示C–C/C=C、C–O/C–N和C=O键；N 1s谱显示–NH₂和=N–物种；O 1s谱证实了含氧基团的存在，包括C=O、C–O和C-OH键。这些杂原子官能团有助于改善电化学性能。

3.4 EIS和CV探测电荷转移行为

EIS奈奎斯特图显示，裸GCE的电荷转移电阻（R_ct）为2470 Ω，经MSAC修饰后显著降低至547 Ω，表明导电性增强和界面电子传输加快。TYR固定化后R_ct升高至1580 Ω，但仍远低于裸GCE，说明酶层成功固定并形成了稳定的分层界面。CV测试中，MSAC@GCE表现出最小的峰电位差（ΔE_p ≈ 0.20 V），显示出优越的可逆性和更快的电荷转移行为；TYR–MSAC@GCE的ΔE_p略有增大（≈ 0.26 V），但仍优于裸GCE。

3.5 TYR–MSAC@GCE在DPM生物传感中的电化学性能

CV实验表明，在10 μM DPM存在下，TYR–MSAC@GCE展现出最显著的阳极和阴极峰电流，归因于导电MSAC基质与固定化TYR酶之间的协同作用，增强了高效的生物电催化DPM氧化。扫速研究表明，阳极和阴极峰电流与扫速平方根呈线性关系，表明DPM在TYR–MSAC@GCE表面的氧化主要为扩散控制过程。

3.6 DPV分析

DPV测试显示，TYR–MSAC@GCE对0–100 μM浓度范围的DPM表现出清晰的氧化峰（约0.20 V），峰电流随浓度增加而逐渐升高。在5–100 μM范围内，峰电流与DPM浓度呈良好线性关系，回归方程为I_p (μA) = 0.0313[DPM μM] + 3.03 × 10^-6，相关系数R2 = 0.9801。检出限（LOD）为1.86 μM，定量限（LOQ）为6.19 μM，灵敏度为0.0313 μA·μM^-1。

3.7 选择性、干扰、稳定性、重现性和重复性

选择性研究表明，在三倍浓度（150 μM）的常见干扰物（AA、谷胱甘肽、甲硝唑、环丙沙星、Na⁺、K⁺）存在下，TYR–MSAC@GCE对50 μM DPM的检测表现出优异的选择性，RSD值小于5%（4.84%）。稳定性评估显示，在30天内传感器保持了93.8%的初始电流响应。重现性（五个不同电极）的RSD为4.11%，重复性（同一电极五次连续测量）的RSD为4.62%，表明传感器具有良好的可靠性和一致性。

3.8 实际样品应用

将商品化人血清用PBS稀释10倍后，通过标准加入法进行DPM检测。向稀释血清中添加已知浓度的DPM（5、25、50 μM），回收率分别为102.6%、99.04%和101.4%，RSD分别为1.4%、2.1%和2.5%，证实了传感器在真实生物样品中测定DPM的可行性。

四、总结与结论

本研究制备了一种可持续且高效的基于TYR的伏安生物传感器，利用玉米芯壳活性炭作为廉价环保的电极材料来检测DPM。化学活化的MSAC具有高度多孔结构、大的电活性表面积和丰富的表面官能团，为TYR提供了优异的固定化能力并促进了快速电子转移。结构表征证实了MSAC富含杂原子的部分有序碳框架。电化学分析表明，MSAC修饰有效降低了电荷转移电阻并增强了氧化还原可逆性。TYR的固定化为传感器带来了基于酶生物识别的高选择性。TYR–MSAC@GCE在5–100 μM浓度范围内对DPM呈线性响应，具有低检出限、高灵敏度和稳定的分析性能。该生物传感器对常见干扰物表现出优异的选择性，具有良好的重现性和重复性（RSD < 5%），并在30天后保持了超过93%的初始响应。在稀释人血清中成功测定DPM并获得良好的回收率，表明该生物传感器在实际生物样品分析中的可行性。总体而言，本研究揭示了农业废弃物基活性炭作为可持续酶电化学生物传感器平台的潜力，为临床和生物医学诊断应用中追求绿色、低成本、高性能的传感设备提供了机会。