基于壳聚糖和卡波姆的含有干酪乳杆菌后生元与灭活益生菌的药妆凝胶精华液的开发

《Gels》：Development of Pharmabiotic Gel-Serums with Lacticaseibacillus casei Postbiotics and Paraprobiotics Using Chitosan and Carbopol

　　

摘要 后生元和灭活益生菌制剂作为非活菌来源的微生物衍生组分，在局部外用制剂开发中受到越来越多的关注，为含有活菌的系统提供了一种替代方案。然而，其理化性质和生物学性能可能在很大程度上取决于聚合物载体，且目前针对来源于同一微生物源的后生元和灭活益生菌组分在不同凝胶基质中的直接比较研究仍然有限。本研究旨在开发并比较评价基于卡波姆（Carbopol?）和壳聚糖的含有干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei）来源后生元（postbiotic，PB）和灭活益生菌（paraprobiotic，PPB）组分的药妆凝胶精华液。研究人员对制剂的外观、pH值、延展性和流变学行为进行了表征，并评价了其抗菌活性、对预形成生物膜生物量的影响以及DPPH自由基清除活性。空白卡波姆（Carbopol?）和壳聚糖制剂以及游离PB和PPB组分作为对照被纳入研究，以区分制剂基质相关效应与完整制剂所观察到的效应。所开发的凝胶精华液表现出均匀的初始宏观特征，pH值范围为4.22至5.66，并呈现假塑性剪切变稀行为。在含PB的系统中，CA-CS-PB表现出显著的抗菌活性，对白色念珠菌（Candida albicans）和克柔念珠菌（Candida krusei）的抑菌圈直径分别为18.00 mm和19.93 mm，对两种菌株的最低抑菌浓度（MIC）值均为1156 μg/mL。CA-CS-PB还使预形成的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜生物量分别减少92.89%和87.63%，并表现出最高的DPPH自由基清除活性（73.50%）。在含PPB的系统中，CA-C-PPB使预形成的S. aureus和P. aeruginosa生物膜生物量分别减少94.63%和93.71%。空白制剂也表现出可测量的生物学响应，表明完整制剂的活性应被解释为制剂水平效应，而非仅归因于所掺入的PB或PPB组分。由于PB和PPB以不同浓度（分别为5%和1% w/w）掺入，这些发现不应被解释为对其内在生物学效力的等效剂量比较。总体而言，研究结果证明了将L. casei来源的PB和PPB组分掺入不同聚合物凝胶精华液系统的可行性，并强调了药妆组分和载体基质对制剂性能的影响。这些结果支持将这些系统作为局部外用制剂平台进行进一步研究；然而，在确立皮肤化妆品或皮肤病学适用性之前，储存稳定性、释放行为、组成表征以及与皮肤相关的安全性和性能仍需进一步评价。

论文解读

一、研究背景与问题

皮肤作为人体最大的器官，是抵御物理、化学和生物损伤的第一道防线，同时参与免疫调节、防止经表皮水分过度流失并维持组织稳态。健康皮肤表面栖息着复杂而动态的微生物生态系统，对维持屏障完整性和皮肤免疫功能至关重要。当皮肤微生态失衡或屏障受损时，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及念珠菌属等机会性致病微生物易于定植，从而增加急性和慢性皮肤感染的易感性。这些病原体能够形成高度组织化的生物膜，微生物细胞被包裹在细胞外聚合物基质中，显著增强了对抗菌药物和宿主免疫防御的抵抗力，导致伤口愈合延迟、治疗疗效降低，并加剧抗菌药物耐药性的负担。

近年来，化妆品科学的发展使局部皮肤护理产品从单纯的清洁或美学改善功能转变为能够支持皮肤生理和微生态稳态的生物活性制剂。凝胶精华液因其质地轻盈、吸收迅速、含水量高、延展性优异和感官特性良好而受到广泛关注。益生菌微生物及其衍生的生物活性产物因其广泛的生物学活性而成为下一代皮肤化妆品制剂的候选成分。然而，将活菌掺入局部外用产品面临储存条件依赖性强、配方组成影响大以及免疫受损或皮肤屏障受损患者安全性担忧等挑战。后生元和灭活益生菌作为非活菌来源的微生物衍生制剂，具有更高的理化稳定性、更长的保质期、更简便的制造和储存过程以及更低的微生物易位或感染风险，成为传统益生菌的安全稳定替代品。

尽管已有研究探讨了益生菌衍生代谢物或局部水凝胶载体，但将来源于同一微生物源的后生元和灭活益生菌组分掺入不同聚合物凝胶基质并进行直接比较的研究仍然有限。聚合物载体对后生元和灭活益生菌制剂理化及生物学性能的影响尚未得到系统阐明。卡波姆和壳聚糖是两种应用广泛的聚合物载体，具有截然不同的理化特性和功能性质。卡波姆是合成交联聚丙烯酸聚合物，能够形成透明高黏度水凝胶；壳聚糖则是天然阳离子多糖，除作为可生物降解和生物相容的聚合物载体外，还具备内在的抗菌、抗生物膜、抗氧化、生物黏附和促进伤口愈合等特性。基于上述背景，本研究旨在利用卡波姆和壳聚糖作为替代聚合物递送系统，开发含有干酪乳杆菌来源后生元和灭活益生菌组分的多功能药妆凝胶精华液，并系统评价其理化性质、流变学特性及生物学性能。

二、研究概述与结论

研究人员成功开发了基于卡波姆和壳聚糖的药妆凝胶精华液。通过初步筛选确定卡波姆浓度为0.25%（w/w）、壳聚糖浓度为0.30%（w/w）为最优聚合物浓度。后生元组分以5%（w/w）掺入，灭活益生菌组分以1%（w/w）掺入。所有制剂均表现出均匀的初始宏观特征、皮肤相容的弱酸性pH值（4.22至5.66）和假塑性剪切变稀行为。流变学分析显示所有制剂均符合Herschel–Bulkley模型，流动行为指数n值介于0.52至0.78之间。抗菌活性评价表明，含后生元制剂普遍表现出强于含灭活益生菌制剂的抗菌活性，其中壳聚糖基后生元制剂CA-CS-PB对白色念珠菌和克柔念珠菌表现出最大的抑菌圈直径（分别为18.00 mm和19.93 mm）和最低的MIC值（1156 μg/mL）。抗生物膜活性评价显示，CA-C-PPB对预形成的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜生物量分别减少94.63%和93.71%，CA-CS-PB分别减少92.89%和87.63%。DPPH自由基清除活性评价表明，CA-CS-PB表现出最高的清除活性（73.50%）。空白制剂也表现出可测量的生物学响应，表明完整制剂的活性应被解释为制剂水平效应。该研究发表在《Gels》期刊上，证明了将干酪乳杆菌来源后生元和灭活益生菌组分掺入不同聚合物凝胶精华液系统的可行性，并强调了药妆组分和载体基质对制剂性能的共同影响。

三、关键技术方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：通过离心和过滤获得含细胞外代谢物的无细胞上清液，经冷冻干燥制备后生元组分；通过离心收集菌体、PBS洗涤、80°C热处理30分钟灭活后冷冻干燥制备灭活益生菌组分，并通过MRS琼脂和营养琼脂培养确认无存活菌落；采用流变仪测定剪切应力-剪切速率数据并拟合Herschel–Bulkley模型；采用pH计测定制剂pH值；采用改良玻片法测定延展性；采用琼脂孔扩散法和肉汤微量稀释法评价抗菌活性；采用结晶紫微量板法评价对预形成生物膜生物量的影响；采用DPPH自由基清除法评价抗氧化活性。

四、研究结果

2.1 聚合物浓度的筛选：初步制剂筛选显示，0.25%（w/w）卡波姆和0.30%（w/w）壳聚糖在结构一致性和延展便利性之间提供了最佳平衡，被选为最终制剂浓度。

2.2 卡波姆基药妆凝胶精华液的开发：采用卡波姆940作为胶凝聚合物，经三乙醇胺中和形成透明均质凝胶基质，后生元以5%（w/w）和灭活益生菌以1%（w/w）掺入，制备了空白制剂（CA-C-Blank）、后生元制剂（CA-C-PB）和灭活益生菌制剂（CA-C-PPB）。

2.3 壳聚糖基药妆凝胶精华液的开发：采用中分子量壳聚糖作为天然聚合物载体，柠檬酸一水合物用于溶解壳聚糖，制备了空白制剂（CA-CS-Blank）、后生元制剂（CA-CS-PB）和灭活益生菌制剂（CA-CS-PPB）。

2.4 流变学表征：所有制剂均符合Herschel–Bulkley模型，拟合系数为99.4%至100.0%，R²值为0.994至1.000。流动行为指数n值介于0.52至0.78之间，均小于1.0，表明所有制剂均呈现假塑性剪切变稀流动行为。在10 s^?1剪切速率下，预测表观黏度范围为82.12至215.96 Pa·s；在100 s^?1下范围为34.64至71.63 Pa·s。卡波姆基制剂中，CA-C-Blank在两种剪切速率下均表现出最高预测表观黏度；壳聚糖基制剂中，CA-CS-PB在10 s^?1下表现出最高预测表观黏度，CA-CS-PPB在100 s^?1下表现出最高值。

2.5 pH值测定：所有制剂pH值范围为4.22±0.01至5.66±0.01，处于与生理皮肤表面相容的弱酸性范围内。后生元制剂在两种聚合物系统中表现出几乎相同的pH值（CA-C-PB为4.23±0.05，CA-CS-PB为4.22±0.01），灭活益生菌制剂也表现出相当的pH值（CA-C-PPB为5.66±0.01，CA-CS-PPB为5.64±0.03）。

2.6 延展性分析：卡波姆基制剂表现出大于相应壳聚糖基制剂的延展直径和延展面积。CA-C-PPB表现出最大的延展性（平均延展直径20.35 mm，延展面积325.3 mm²），CA-CS-PB表现出最低的延展面积（平均延展直径15.25 mm，延展面积182.7 mm²）。

2.7 宏观特征：空白制剂呈无色外观，壳聚糖空白制剂呈轻微乳光，卡波姆空白制剂呈透明。后生元制剂呈棕色，灭活益生菌制剂呈乳白色并略带不透明。所有制剂均表现出均匀的宏观外观，无可见颗粒聚集、沉淀或相分离。

2.8 抗菌活性：游离后生元组分对所有测试微生物均表现出抗菌活性，抑菌圈直径范围为4.47至8.40 mm。掺入制剂后抑菌圈直径普遍增大。CA-CS-PB对克柔念珠菌和白色念珠菌表现出最大的抑菌圈直径（分别为19.93 mm和18.00 mm），MIC值为1156 μg/mL。游离灭活益生菌组分的抗菌活性较低，抑菌圈直径范围为2.47至8.63 mm。CA-C-PPB对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌未产生可检测的抑菌圈，而CA-CS-PPB抑制了所有测试微生物。空白壳聚糖制剂对所有测试微生物均表现出可测量的抑制作用，表明载体系统本身对整体抗菌性能有贡献。

2.9 抗生物膜活性：CA-C-Blank对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌预形成生物膜生物量分别减少18.00%和15.00%，CA-CS-Blank分别减少28.00%和24.00%。游离后生元组分分别减少51.84%和42.64%。CA-C-PB分别减少83.07%和67.66%，CA-CS-PB分别减少92.89%和87.63%。游离灭活益生菌组分分别减少25.59%和24.12%。CA-C-PPB分别减少94.63%和93.71%，CA-CS-PPB使铜绿假单胞菌生物膜生物量减少81.94%，但对金黄色葡萄球菌未观察到可检测的减少。

2.10 DPPH自由基清除活性：CA-C-Blank和CA-CS-Blank分别表现出12.00%和18.00%的清除活性。游离后生元组分表现出51.51%的清除活性，CA-C-PB为65.23%，CA-CS-PB为73.50%。游离灭活益生菌组分为38.55%，CA-C-PPB为40.90%，CA-CS-PPB为50.45%。后生元制剂普遍表现出高于相应灭活益生菌制剂的DPPH自由基清除活性，壳聚糖基制剂高于卡波姆基制剂。

五、讨论与结论

讨论部分指出，后生元制剂表现出强于灭活益生菌制剂的抗菌活性，这与后生元含有有机酸、细菌素、抗菌肽、生物表面活性剂等细胞外代谢物的特性一致。空白制剂的生物学响应表明载体系统并非生物学惰性，完整制剂的活性应被解释为制剂水平效应。由于PB和PPB以不同浓度掺入，观察到的差异代表制剂在选定浓度下的性能，不应被解释为等效剂量比较。研究存在体外评价局限、缺乏组成表征、未进行皮肤相关安全性和性能评价等局限性。研究结论为：本研究证明了将干酪乳杆菌来源后生元和灭活益生菌组分掺入卡波姆和壳聚糖基药妆凝胶精华液系统的可行性，所开发制剂表现出均匀的初始宏观特征、皮肤相容的pH值、假塑性剪切变稀行为和制剂依赖性延展性，并表现出抗菌活性、对预形成生物膜生物量的减少作用以及DPPH自由基清除活性。这些发现为L. casei来源药妆凝胶精华液提供了初步的理化和体外生物学表征，支持其作为局部外用制剂平台进行进一步研究，但长期储存稳定性、释放行为、组成表征、细胞相容性、刺激性和致敏性评估以及离体渗透/穿透研究仍需开展，以确立其皮肤化妆品或皮肤病学适用性。