尿毒症血清暴露后静脉平滑肌细胞基因表达与信号通路活性的改变

《International Journal of Molecular Sciences》：Alterations of Gene Expression and Signaling Pathway Activity in Venous Smooth Muscle Cells After Uremic Serum Exposure

　　

摘要 尿毒症是慢性肾脏病（CKD）患者，尤其是终末期肾脏病（ESKD）患者中最常见的病理生理表现。尿毒症可导致多种静脉特异性血管疾病，如肾静脉血栓形成（RVT）、深静脉血栓形成（DVT）以及透析通路相关的静脉狭窄。研究人员此前的一项研究表明，与动脉平滑肌细胞（aSMCs）相比，尿毒症血清暴露诱导猪静脉平滑肌细胞（vSMCs）产生不同的细胞反应。为探究静脉特异性细胞反应背后的潜在机制，研究人员利用批量RNA测序（bulk RNA sequencing）检测了尿毒症血清暴露后猪vSMCs的差异基因表达。差异表达基因（DEG）分析显示，尿毒症血清处理后，408个基因上调，387个基因下调。基因本体论生物学过程（GO Biological Process）分析表明，尿毒症血清暴露导致细胞能量消耗相关活动（如细胞周期）的转录组下调，以及细胞对内质网（ER）应激反应、未折叠蛋白反应和缺氧反应的转录组正富集。基因集富集分析（GSEA）和过表达分析（ORA）均获得相似结果。ORA还揭示了一些预测为转录组下调的信号通路，如Hippo信号通路、黏着斑（Focal Adhesion）和细胞骨架结构调控通路。ORA还预测了若干与细胞应激反应和废物处理相关的正富集信号通路。为精确识别vSMC特异性改变，研究人员进行了基于交互作用的KEGG GSEA分析。该分析揭示了vSMCs与aSMCs之间若干显著不同的反应，如内质网中的蛋白质加工、整合应激反应（Integrated Stress Response）信号通路和线粒体自噬（Mitophagy）在vSMCs中表现出更强的正反应，而氧化磷酸化在aSMCs中表现出更强的正反应。这些改变的信号通路可能是CKD/ESKD患者中观察到的静脉特异性临床表现（如动静脉瘘中静脉段狭窄）的原因。

尿毒症血清暴露下静脉平滑肌细胞转录组重塑的机制解读

一、研究背景与问题

慢性肾脏病（CKD）是全球最常见且增长最快的现代疾病之一，给公共卫生带来沉重负担。随着肾功能下降，患者易出现全身性并发症，其中血管疾病尤为突出。在晚期CKD和终末期肾脏病（ESKD）患者中，心血管和血管并发症是发病和死亡的主要因素。CKD的核心代谢异常之一是尿毒症，其特征为尿素及其他本应由肾脏清除的毒素在体内潴留。尿毒症对血管系统具有广泛影响，可促进炎症、氧化应激、内皮损伤、血管钙化以及血管平滑肌细胞（VSMCs）的异常重塑。

尽管CKD的动脉并发症已被广泛研究，静脉血管疾病同样高度相关，尤其在透析通路和CKD相关血栓并发症的背景下。静脉在生物学和临床上与动脉存在显著差异。正常解剖条件下，经典动脉粥样硬化病变主要发生于动脉，静脉罕见。然而，静脉在血管损伤或干预后，包括动静脉瘘（AVF）建立、球囊血管成形术和支架置入后，极易发生狭窄、血栓形成、纤维化和适应不良性重塑。这一区别在接受血液透析的患者中尤为重要，AVF常被创建以提供长期血管通路。在AVF静脉中，高压动脉血直接流入静脉系统，使静脉壁暴露于升高的压力、改变的剪切应力和反复穿刺损伤，可引发动脉瘤形成、狭窄、血栓形成、静脉高压和通路功能障碍等一系列结构和功能并发症。

在细胞水平上，VSMCs在维持血管壁完整性和调节血管张力方面发挥核心作用。然而，在病理条件下，VSMCs可发生显著的表型和功能改变。既往研究已表明，静脉平滑肌细胞（vSMCs）和动脉平滑肌细胞（aSMCs）在不同环境条件、疾病状态和损伤反应中存在重要差异。研究人员既往的体外研究证实，与aSMCs相比，vSMCs具有更高的增殖和迁移能力，对血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）等去分化信号更敏感，黏着斑和细胞外基质相关蛋白表达改变，且JNK、p38 MAPK和AKT等信号通路在vSMCs中激活更强。既往转录组学研究也揭示了动脉-静脉在收缩表型、细胞外基质组成、成纤维细胞激活、炎症潜力和氧化应激反应相关基因表达方面的重要差异。重要的是，研究人员的批量RNA测序研究明确表明，vSMCs和aSMCs使用不同的基因集来调控同一通路。此外，暴露于尿毒症血清的aSMCs在调控细胞氧化还原稳态、细胞废物处理系统和内质网应激的信号通路中表现出转录组富集。

尽管已有这些认识，尿毒症条件对vSMCs的特异性影响仍不清楚。许多既往体外研究依赖候选基因方法。例如，研究人员此前的一项研究表明，与aSMCs相比，尿毒症血清刺激的细胞迁移在vSMCs中更为显著，而尿毒症血清刺激的早期成骨标志物表达和炎症反应在aSMCs中比vSMCs更为显著。然而，这些针对性研究忽视了更广泛的转录组变化和未专门检测的其他信号通路。此外，既往测序研究往往聚焦于基线动脉-静脉差异、器官特异性血管异质性或组织水平细胞组成，而非尿毒症血清对vSMCs的特异性影响。尿毒症研究中也存在类似局限性，检测对象多为血细胞或钙化血管组织，尚无转录组学研究探讨尿毒症毒素对vSMCs的影响。因此，需要一种全面且无偏的方法来定义vSMCs如何响应尿毒症环境。

二、研究开展内容与结论

本研究利用批量RNA测序技术，研究了猪原代vSMCs对尿毒症血清的转录组响应。选用猪细胞是因为猪在解剖学和生理学上比小型啮齿动物模型更接近人类。该研究旨在通过识别尿毒症血清暴露后vSMCs中的差异表达基因（DEGs）和转录组富集的信号通路，为CKD/尿毒症相关静脉疾病和静脉重塑的分子基础提供新见解。

研究结果显示，尿毒症血清暴露诱导vSMCs发生广泛但选择性的转录组重塑。差异表达分析共鉴定出408个显著上调和387个显著下调的基因。功能富集分析表明，下调基因富集于细胞周期进程和染色体动态相关生物学过程，包括有丝分裂细胞周期、染色体分离、细胞分裂、DNA复制和细胞器分裂，以及血管发育相关过程如血管系统发育和血管形态发生。相反，上调基因富集于应激和蛋白质稳态反应，如对内质网应激的反应、内质网相关降解通路、对未折叠蛋白的反应和细胞内蛋白质转运，以及缺氧反应和细胞对氧水平的反应。

KEGG通路分析进一步揭示了通路水平的变化。GSEA显示内质网中蛋白质加工在尿毒症血清处理的vSMCs中正富集，而细胞周期、DNA复制和细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路预测为转录组下调。ORA提供了额外的通路分辨率，下调通路包括细胞周期、DNA复制、肌细胞细胞骨架、黏着斑、Hippo信号通路、马达蛋白、TGF-β信号通路、整合素信号、肌动蛋白细胞骨架调控以及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路。上调通路包括内质网中的蛋白质加工、自噬-动物、内吞作用、线粒体自噬-动物、溶酶体、氨基酸生物合成、细胞凋亡、P53信号通路、MAPK信号通路和mTOR信号通路。

通路映射分析显示，细胞周期通路中大量基因下调，包括Smc1、TGFB、Ink4c、Kip1/2、CycD、CycE、CDK2、CycA、E2F1/2/3、GADD45、PCNA、Cdc6、ORC、MTBP、MCM、Sororin、CDK1、AuroraB、Mps1、KNL1、Sgo1、Esp1和Emi1。值得注意的是，其中一些下调基因是细胞周期的抑制因子，如Kip1/2、Ink4c和GADD45。Hippo信号通路中大量基因下调，包括TGFB、BMPs、Wnt、Fzd、FRMD、F-actin、PP2A、ASPP2、TEAD、CTFG、Gli2、AREG、Id2和CycD，仅Par3、Ajub、PUMA和FGF1上调。内质网蛋白质加工通路中大量基因上调，包括Sec62/63、OSTs、NEF、BiP、GRP94、Hsp40、GlcII CNX、ERP57、CRT、UGGT、ERManI、EDEM、Ero1、PDIs、TRAP、TRAM、Derlin、ATF6、IRE1、SVIP、GADD34、WFS1和CHOP。自噬通路中大量基因上调，包括RAS、ERK、BNIP3、IRE1、GCN2、LC3、ATG13、Rab8a/39b、WIPI、MTMR3、Jummy、Receptor和Rab7。线粒体自噬通路中RAS、BNIP3、TFEB、Rab7和LC3表达也上调。

肌细胞细胞骨架通路图谱显示，与细胞外基质和膜-细胞骨架结构相关的大量基因下调，包括COL、VCAN、ELM、THBS、ITGA、ITGB、DES、ACTB/G、SGCD、ATP1A/B、MYH、MYBPH、TPM1、TPM2、MYOM、PDLIM、FHL、ANKRD、TMOD和MYOM，而COL6A、FBLN1_2、SGCB、VIM、TNNI1、TNNI3、NEBL、MYOZ、ANKB和SYNE1等基因上调。黏着斑通路显示参与细胞外基质相互作用、整合素信号和肌动蛋白组织的基因广泛下调，包括ITGA/ITGB、caveolin、RTK、Shc、PI3K、actinin、filamin、vinculin、parvin、MLCP、MLCK、actin、β-catenin、Cyclin D和Bcl-2，而ECM、PAK和ERK1/2表达增加。TGF-β信号通路中大量基因下调，包括Activin B、BMPR1、RGMa/b、GERM、BMP、THBS1、THSD4、TGFβ、TGFβRII、FST、Lefty、GARP和Id，而BMP2/4/6、Tfr1、Activin、ERK和TMEM53等基因上调。

缺氧诱导因子（HIF）通路映射显示，Glut、ERK、MNK、PHD、CamK、TFRC、VEGF和Glut1上调，而GF、IL-6、RTK、PI3K、HIF-1α、PLCγ、NF-κB、ANGPT、END1、PFK2和Bcl-2下调。

直接比较vSMCs和aSMCs的转录组数据发现，基因水平上有5096个基因在FDR<0.05时表现出显著交互作用，3813个基因在FDR<0.01时仍显著。动脉和静脉的尿毒症血清效应大小几乎无相关性（Pearson r=?0.01），表明两种细胞亚型的转录组反应存在显著差异。基于交互作用的KEGG GSEA识别出若干反应显著不同的通路，其中内质网中的蛋白质加工、整合应激反应信号通路和线粒体自噬在vSMCs中表现出更强的正反应，而氧化磷酸化在aSMCs中表现出更强的正反应。

三、研究意义

该研究首次系统描绘了尿毒症血清暴露下vSMCs的转录组变化图谱，揭示了静脉特异性反应的通路基础。研究发现vSMCs在尿毒症条件下可能从分化和结构维持程序转向应激反应和细胞废物处理通路。这些转录组变化可能有助于理解CKD/ESKD相关的静脉重塑，包括AVF狭窄、血栓形成和通路功能障碍。研究识别的静脉特异性信号通路，如内质网中的蛋白质加工、整合应激反应信号通路、线粒体自噬和细胞对缺氧的反应，可能代表CKD/ESKD患者静脉特异性临床表现（如AVF狭窄和血栓形成）的新靶点。该研究为后续蛋白质水平研究或动物模型研究奠定了基础。

四、主要技术方法

该研究采用了以下关键技术方法：从4月龄雌性约克夏猪（62 kg）颈静脉分离原代猪vSMCs，使用含30%正常猪血清或30%尿毒症猪血清（BUN 43 mg/dL，肌酐9.5 mg/dL）的DMEM培养基培养，细胞传至第6代，达100%融合度后提取总RNA进行批量RNA测序。差异表达分析以padj≤0.05且|log2FC|≥1为阈值定义DEGs。基因本体论生物学过程富集分析使用R语言clusterProfiler包和猪注释包进行过表达分析。KEGG通路富集同时采用ORA和GSEA两种方法，使用猪（Sus scrofa）KEGG生物代码"ssc"。通路图谱可视化使用Pathview将基因log2FC值投射到KEGG通路示意图上。vSMCs与aSMCs的直接比较采用DESeq2进行细胞类型×血清类型交互作用分析，并使用Pearson相关性比较基因水平效应大小。

五、研究结果

2.1 尿毒症血清改变vSMCs的全局基因表达谱

通过批量RNA测序和差异表达分析，以padj≤0.05且|log2FC|≥1为阈值，鉴定出408个显著上调和387个显著下调的基因，表明尿毒症血清暴露诱导vSMCs发生广泛但选择性的转录组重塑。

2.2 尿毒症血清暴露后vSMCs的功能富集分析

GO生物学过程ORA显示，下调基因富集于细胞周期进程和染色体动态相关过程，包括有丝分裂细胞周期、染色体分离、细胞分裂、DNA复制和细胞器分裂，以及血管发育相关过程。上调基因富集于应激和蛋白质稳态反应，如对内质网应激的反应、内质网相关降解通路、对未折叠蛋白的反应和细胞内蛋白质转运，以及缺氧反应和细胞对氧水平的反应。KEGG GSEA显示内质网中蛋白质加工正富集，细胞周期、DNA复制和细胞因子-细胞因子受体相互作用下调。KEGG ORA显示下调通路包括细胞周期、DNA复制、肌细胞细胞骨架、黏着斑、Hippo信号通路、马达蛋白、TGF-β信号通路、整合素信号、肌动蛋白细胞骨架调控和AGE-RAGE信号通路，上调通路包括内质网中的蛋白质加工、自噬、内吞作用、线粒体自噬、溶酶体、氨基酸生物合成、细胞凋亡、P53信号通路、MAPK信号通路和mTOR信号通路。

2.3 KEGG通路映射

2.3.1 尿毒症血清暴露改变调控细胞周期和细胞增殖的信号通路

细胞周期通路中大量基因下调，包括细胞周期抑制因子Kip1/2、Ink4c和GADD45，表明细胞周期通路受到显著扰动。Hippo信号通路中大量基因下调。P53、MAPK和mTOR信号通路预测为正富集。

2.3.2 尿毒症血清暴露上调vSMCs中与细胞应激反应和废物处理程序相关的基因

内质网蛋白质加工通路中大量基因上调，包括UPR相关基因。自噬通路和线粒体自噬通路中大量基因上调，表明vSMCs可能上调与细胞应激适应通路相关的基因，这些反应可能代表尿毒症条件下处理受损蛋白质、改变细胞器和代谢应激的代偿机制。

2.3.3 尿毒症血清暴露改变vSMCs收缩性、细胞骨架结构和表型转换

肌细胞细胞骨架通路中大量细胞外基质和膜-细胞骨架结构相关基因下调。黏着斑通路中参与细胞外基质相互作用、整合素信号和肌动蛋白组织的基因广泛下调。TGF-β信号通路中大量基因下调。这些变化表明尿毒症血清可能破坏vSMCs的细胞黏附和细胞骨架动态，影响收缩表型向合成表型的转换。

2.3.4 尿毒症血清暴露上调vSMCs中与缺氧反应相关的基因

HIF通路中Glut、ERK、MNK、PHD、CamK、TFRC、VEGF和Glut1上调，而HIF-1α下调，PHD上调可能通过促进HIF-1α降解而损害细胞适应缺氧条件的能力。

2.3.5 vSMCs与aSMCs转录组数据的直接比较

交互作用分析显示5096个基因在FDR<0.05时表现出显著交互作用，动脉和静脉的尿毒症血清效应大小几乎无相关性。基于交互作用的KEGG GSEA显示内质网中的蛋白质加工、整合应激反应信号通路和线粒体自噬在vSMCs中表现出更强的正反应，而氧化磷酸化在aSMCs中表现出更强的正反应。

六、讨论与结论

讨论部分指出，尿毒症血清暴露诱导vSMCs发生广泛的转录组重塑，下调细胞周期、DNA复制、染色体组织、黏着斑、整合素信号、肌动蛋白细胞骨架调控和肌细胞细胞骨架等信号通路，上调内质网应激、自噬、线粒体自噬、溶酶体、细胞凋亡、缺氧、MAPK、p53和mTOR等信号通路。这些发现表明，暴露于尿毒症血清的vSMCs可能从分化和结构维持程序转向应激反应和细胞废物处理通路。

与aSMCs的发现相比，vSMCs和aSMCs在尿毒症血清暴露后均出现细胞能量消耗相关通路的转录组下调，以及细胞应激反应和废物处理信号通路的正富集。然而，内质网应激的细胞反应在两种细胞中完全不同：aSMCs中内质网蛋白质加工通路预测为转录组下调，而vSMCs中该通路预测为正富集。vSMCs中检测到而aSMCs中未检测到的一个主要变化是细胞对缺氧反应的正富集。尿毒症毒素可促进和加重细胞及全身水平的缺氧，增加氧消耗并降低整体组织氧合。

研究结论指出，该转录组研究识别了尿毒症血清暴露后vSMCs中可能改变的若干信号通路。显著例子包括与细胞周期、DNA复制、肌细胞细胞骨架和肌动蛋白细胞骨架调控相关的下调基因，这与在aSMCs中的观察相似。这些变化可能有助于细胞表型转换，如研究人员在尿毒症条件下在aSMCs和vSMCs中均观察到的细胞去分化。该研究还识别了尿毒症血清暴露后可能改变的静脉特异性信号通路，如内质网中的蛋白质加工、整合应激反应信号通路、线粒体自噬和细胞对缺氧的反应，这些通路在vSMCs中表现出更强的正反应。这些通路可能代表CKD/ESKD患者中观察到的静脉特异性临床表现（如AVF狭窄和血栓形成）的新靶点。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。