《Biomolecules》：Beyond Exosomes: Biological Properties, Isolation Challenges, and Functional Redefinition of Non-Vesicular Extracellular Nanoparticles (NVEPs)
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）数十年来一直主导着细胞间通讯的研究。然而，2018年exomeres的发现揭示，传统外泌体制备物中含有大量长期被忽视的非膜性纳米颗粒。此后，包括supermeres和SECmeres在内的其他非囊泡性细胞外纳米颗粒（Non-Vesicular Extracellular Nanoparticles, NVEPs）也相继被报道。这些颗粒大多直径小于50 nm，却携带了此前被认为仅由外泌体递送的蛋白质和RNA货物。因此，部分曾归因于外泌体的功能现在需要重新分配。本综述总结了NVEPs的分类、货物组成和结构特征，随后比较了差速超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱和流场流分离技术在NVEP分离中的各自局限性，以及它们联合使用的策略。此外，本文从非囊泡性细胞外RNA（nv-RNA）的细胞外稳定性、细胞摄取途径和下游效应三个层面，讨论了区分NVEPs与囊泡性EVs的功能机制。当前证据表明，NVEPs在癌症和神经退行性疾病中富集疾病相关货物，并在液体活检和药物递送方面显示出潜力。然而，定义边界的模糊性、参考物质的缺失以及体内证据的不足，共同阻碍了该领域的定量研究和临床转化。由于这些局限性在很大程度上源于统一技术标准的缺乏，建立国际公认的分离与表征标准是NVEP研究走向成熟的先决条件。
1. 引言
1.1 细胞外颗粒（ECPs）异质性研究的演进
细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有真核和原核细胞自然释放的纳米级颗粒，长期被视为细胞间通讯的关键介质。早期研究主要将EVs视为脂质双分子层包裹结构的异质群体，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体，它们在尺寸、生物发生和功能特性上差异显著。随着高分辨率分析技术和单颗粒检测平台的发展，EVs的复杂性和多样性远超早期假设。这种异质性为疾病诊断提供了丰富的生物标志物来源，但也对精确解析EVs生物学功能及其临床转化构成重大障碍。近年来，研究范围已从膜结合囊泡扩展到更广泛的细胞外颗粒（ECPs）谱系，涵盖脂蛋白、RNA结合蛋白复合物以及新发现的非囊泡性细胞外纳米颗粒（NVEPs）。这些进展推动该领域从对“囊泡”的笼统描述转向对不同ECP亚群的精细分类和功能表征。
1.2 NVEP概念的提出与“超越外泌体”的科学必要性
尽管EV研究取得了长足进展，但近期发现的非膜性NVEPs，特别是exomeres和supermeres，挑战了以脂质双分子层为核心的传统EV定义。Exomeres于2018年由Zhang等人利用非对称流场流分离技术（AF4）首次鉴定并命名，揭示了传统外泌体制备物中长期被忽视的非囊泡成分。研究表明，曾被认为主要存在于外泌体中的特定蛋白质和核酸，实际上更富集于这些新发现的非膜性NVEPs中，促使研究人员重新评估细胞外通讯的物质基础。例如，supermeres被发现携带与癌症、阿尔茨海默病（AD）和心血管疾病相关的货物，且大多数细胞外RNA实际上与supermeres相关，而非传统的小细胞外囊泡（sEVs）。此外，在中枢神经系统中鉴定出的新型NVEP亚群，如SECmeres，携带脑特异性标志物，在区分AD患者方面显示出比sEVs更大的诊断潜力。
1.3 NVEPs与传统EVs的混淆及其对功能解读的影响
该领域当前面临的核心问题是NVEPs与传统EVs在分离纯化过程中的共分离，这导致许多先前归因于外泌体的生物学功能可能被错误分配。由于缺乏标准化的分离方法，差速超速离心等常规技术往往无法有效分离非膜性NVEPs与膜性EVs，导致最终制备物中两者混杂。这种混淆直接损害了功能解读的准确性。例如，某些据报道由外泌体介导的功能，如代谢重编程和耐药性转移，实际上可能由supermeres执行。此外，尽管部分非囊泡性细胞外RNA（nv-RNA）易受核酸酶降解，但它在特定复合物内表现出高稳定性并参与细胞间通讯，这一机制与传统模型中囊泡介导的保护机制根本不同。此外，NVEPs与EVs在细胞摄取途径和体内分布上也存在差异。
1.4 本综述范围与关键科学问题的提出
本综述旨在系统总结新兴NVEP领域的研究现状，重点关注exomeres、supermeres及其他非囊泡性细胞外颗粒的生物学特性、分离挑战和功能再定义。首先描述NVEPs区别于传统EVs的分类标准、货物组成和结构特征；随后批判性评估现有分离纯化技术的局限性，并讨论如何克服因纯度评估不足和缺乏标准化造成的方法学瓶颈；在此基础上分析NVEPs独特的功能机制，并讨论先前归因于外泌体功能的重新分配；最后总结NVEPs在癌症、神经系统疾病和代谢疾病中的经验证据及其转化前景，并提炼当前的理论争议和未解问题，提出建立国际公认的表征指南和整合多组学方法的技术路线图。
2. NVEPs的分类、货物组成与结构特征
2.1 Exomeres与Supermeres在理化性质上的差异：尺寸、密度与非膜性结构
NVEPs代表ECPs谱系中区别于传统脂质双分子层囊泡的新型实体，exomeres和supermeres是其中表征最充分的两个亚型。与直径通常为30-1000 nm且具有明确脂质双分子层的EVs不同，exomeres和supermeres被定义为缺乏典型磷脂双分子层边界的非膜性纳米颗粒。在理化性质上，这两种NVEP亚型表现出显著的尺寸异质性，通常直径小于50 nm，在高分辨率密度梯度中，它们在与含EVs不同的组分中被回收，这使得它们在常规差速超速离心方案中难以有效沉淀或容易与可溶性蛋白混淆。密度梯度离心进一步揭示了它们与EVs的物理分离：经典sEVs在蔗糖中的浮力密度约为1.13-1.19 g/mL，而exomeres和supermeres则分配到更高浮力密度的离散区域，表明其内部组装机制和物质组成与囊泡存在根本差异。此外，在人类大脑和血液中鉴定出一类称为“SECmeres”的小颗粒，同样符合<50 nm的非sEV标准，并富集脑特异性标志物，进一步证实了非膜性纳米颗粒的尺寸结构多样性和组织特异性分布。
2.2 NVEP货物谱：蛋白质、脂质、代谢物与nv-RNA
NVEPs的货物组成与共分离的EVs显著不同，并表现出一定程度的亚型特异性。在核酸货物方面，大多数细胞外RNA实际上与supermeres相关，而非长期假设的外泌体。尽管此类nv-RNA理论上易受核糖核酸酶降解，但它在生物体液和培养基中表现出相对稳定性，表明其以核糖核蛋白复合物或其他保护性结构形式存在。例如，exomeres已被证明富集RNA干扰（RNAi）蛋白，如Argonaute-2和HSP90AB1，以及特定微小RNA（miRNAs），这些miRNAs即使在蛋白酶和表面活性剂处理后仍对核酸酶高度耐受，表明exomeres是高度稳定的非囊泡复合物。在蛋白质组水平上，无论培养条件或分离方法如何，EVs、exomeres和supermeres的蛋白质谱始终保持显著差异。Supermeres特别富集参与细胞外基质（ECM）重塑的成分以及多种疾病相关蛋白，包括癌症相关糖酵解酶、TGFBI、MET和GPC1，AD相关蛋白APP，以及心血管疾病相关蛋白ACE2、ACE和PCSK9。在脂质和代谢物方面，尽管培养条件和纯化策略影响小RNA碱基修饰和脂质组学谱，但NVEPs作为非膜性载体，其脂质组成模式必然与基于脂质双分子层的EVs不同。
2.3 NVEPs的生物发生：未解问题与间接线索
与生物发生途径相对明确的囊泡性EVs相比，NVEPs的生物发生仍是该领域的“黑箱”，仅有零散的间接线索可供推断。由于缺乏脂质双分子层，NVEPs无法通过经典的多泡体（MVB）融合或质膜出芽产生。其形成可能涉及大分子复合物的主动分泌或非常规分泌途径。多项研究指出了潜在的调控节点。例如，神经酰胺转移蛋白（CERT）通过其pleckstrin同源（PH）结构域与内体上的磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）相互作用，介导内质网（ER）与MVBs之间的非囊泡性神经酰胺转运，并与ESCRT-I机制的Tsg101形成复合物。尽管该机制主要与外泌体生物发生相关，但其涉及的“非囊泡性转运”元素可能为NVEP成分的细胞内运输提供分子线索。在应激条件下，细胞可能激活替代性分泌程序。然而，必须承认目前尚无直接证据阐明exomeres和supermeres的具体组装机制或分泌通道。
2.4 蛋白质组学揭示的分子指纹与潜在鉴定标志物
鉴于NVEPs缺乏CD63和CD81等通用膜表面标志物，蛋白质组学已成为定义其身份、解析其相对于EVs的异质性以及发现特异性鉴定标志物的核心工具。高通量质谱（MS）已成功鉴定出多种NVEP特异性分子指纹。N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（GALNS）和甘露糖苷酶α 2B类成员1（MAN2B1）已被确认为exomeres的特异性分子标志物，使其能够与sEVs有效区分。对于supermeres，其蛋白质指纹不仅不同于sEVs和exomeres，还显示出显著的疾病相关性。在中枢神经系统（CNS）研究中，SECmeres被发现富集L1CAM、Syntaxin和Neurogranin的RNA转录本，单细胞测序反卷积进一步揭示了其特异性来源于构成血脑屏障（BBB）的脑内皮细胞。此外，Vesiclepedia和SVAtlas等数据库平台已纳入包括exomeres和supermeres在内的非囊泡颗粒蛋白质组学数据，为跨研究比较和新标志物挖掘提供了标准化参考。
3. NVEP分离纯化的关键技术瓶颈：方法学批判
3.1 差速超速离心过程中NVEPs的丢失与共分离
差速超速离心（dUC）长期以来被视为EV分离的金标准。然而在NVEP研究中，该方法存在显著的方法学盲区。由于NVEPs缺乏脂质双分子层且密度与经典EVs不同，它们在标准dUC方案中的行为难以预测。因其沉降系数小，NVEPs在旨在去除细胞、碎片和大囊泡的低速步骤中仍悬浮于回收的上清液中，并在最终超速离心步骤未能将其沉淀时随最终上清液被丢弃。反之，它们容易与EVs、脂蛋白或蛋白质聚集体非特异性共沉淀，导致分离物纯度严重不足。研究表明，仅通过dUC制备的样品常含有大量可溶性免疫抑制因子，如血管内皮生长因子A（VEGF-A）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1），这些污染物可能掩盖NVEPs的真实生物学活性。此外，dUC产生的高剪切力可能导致NVEPs结构损伤或聚集，其低通量和耗时性进一步限制了在大规模临床样本分析中的应用。因此，通常建议将dUC作为初步浓缩步骤而非最终纯化方法，或与其他高分辨率技术联用。
3.2 密度梯度离心、SEC、AF4及高分辨率分离技术的比较与优化
为克服常规离心的局限性，多种高分辨率分离技术被引入NVEP分离领域。尺寸排阻色谱（SEC）因其操作简便、成本低和良好保留颗粒完整性而被广泛使用，但单独使用时仍存在残留脂蛋白和游离蛋白的问题。为提升其性能，研究人员开发了SEC与超速离心联用的两步方案，或SEC与亲和捕获技术偶联的方案。非对称流场流分离技术（AF4）提供更高分辨率，可基于流体动力学体积对亚微米颗粒进行精细分离，与密度垫超速离心联用时，可从血浆中获得脂蛋白污染极低的高纯度EV和NVEP组分。密度梯度离心能有效区分不同密度的颗粒亚群，是分离exomeres和supermeres的关键步骤，但操作繁琐、耗时长达72小时且回收率相对较低。新兴的整合分离方案试图结合差速离心、过滤、浓缩和高分辨率密度梯度分离，从同一初始材料中依次分离大/小EVs、exomeres和supermeres。此外，超吸收聚合物（SAPs）与SEC联用已被证明是超速离心的有效替代方案。除上述方法外，免疫亲和捕获试剂、微流控平台、混合切向流过滤系统和等电聚焦分离技术也已被应用于NVEPs的分离。
3.3 免疫亲和捕获和微流控技术在亚群分离中的潜力与局限
免疫亲和捕获和微流控技术为精确分离特定NVEP亚群提供了新方案。免疫亲和方法利用NVEP表面的独特分子标志物进行特异性富集。例如，基于糖胺聚糖（GAG）功能化磁珠的方法可在10分钟内去除98.2%的ApoB污染，同时保留93%的CD81阳性颗粒。然而，此类技术高度依赖已知的特异性表面标志物，鉴于NVEPs特异性标志物的定义仍不完善，其广泛应用目前受限。微流控技术在处理小体积和珍贵样本方面显示出独特优势，具有快速、高通量、自动化和低样本消耗等特点。例如，基于电热涡流和介电泳力的微流控装置可在高电导率介质中实现无标记、连续流的尺寸分选，回收率和纯度均达到约80%。ExoCPR平台结合气泡驱动微混合与不混溶过滤，可在29分钟内完成血浆NVEPs的高纯度分离。然而，微流控芯片的复杂设计、制造成本和标准化不足仍是其大规模采用的瓶颈。
3.4 纯度评估现状：如何排除脂蛋白和游离核酸-蛋白质复合物的污染
NVEP分离的核心挑战在于NVEPs与脂蛋白（特别是高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL））以及游离核酸-蛋白质复合物在理化性质上的显著重叠。常规总蛋白定量或单一标志物Western blotting已不足以全面评估NVEP纯度，需要多维正交验证策略。颗粒与蛋白质比值（PtP）已被提出作为定量指标。对于脂蛋白污染，ApoB和ApoA1的特异性检测至关重要。为区分游离核酸-蛋白质复合物，应将核酸酶敏感性测定与高分辨率成像技术相结合，因为NVEP内的nv-RNA表现出与游离RNA不同的稳定性特征。此外，MISEV指南强调应报告非EV成分（如脂蛋白和核糖核蛋白）的阴性对照数据，以确认获得的信号确实来源于NVEPs而非共纯化的污染物。
3.5 自动化分离平台：来自EV领域的经验与NVEP适配系统的未满足需求
在EV领域，分离已从手动、依赖操作者的方案迅速向自动化和高通量平台发展，以提高标准化和可重复性。EXODUS耦合负压振荡与双耦合谐振器诱导的膜振动，实现从多种生物体液中自动化、无标记纯化外泌体。自动化尺寸排阻色谱工作站可实现多个样本的标准化、无人值守并行处理。然而，这些平台是为约40-150 nm的囊泡颗粒设计和校准的，其膜截留分子量、分离窗口和流动参数从未针对小于50 nm的非膜性颗粒进行优化或验证。NVEPs是否能被此类系统有效回收，还是会与游离蛋白质和核糖核蛋白复合物一起穿过分离膜，目前尚不清楚。因此，开发NVEP适配的自动化平台应被视为NVEP研究成熟的方法学优先事项。
4. NVEP货物的功能机制与外泌体功能的重新分配
4.1 nv-RNA细胞外稳定性的机制：从“降解产物”到功能性载体
长期以来，未被脂质双分子层包裹的nv-RNA因其对核糖核酸酶的敏感性而被视为细胞裂解或代谢废物的产物。然而，近期研究表明，尽管缺乏膜保护，部分nv-RNA在生物体液和组织培养基中仍表现出相对稳定性，并执行以细胞间通讯为中心而非蛋白质合成的独特生物学功能。这种稳定性的维持可能依赖于nv-RNA与特定蛋白质形成的复合结构。例如，在AD研究中，人类大脑和血液中已鉴定出直径小于50 nm的SECmeres，尽管缺乏sEVs的特征，但它们富集与L1CAM、Syntaxin和Neurogranin等基因相关的RNA，且这些RNA在区分患者与对照方面比sEV来源的RNA具有更高的显著性。此外，exomeres和supermeres被发现富集多种生物活性分子，特别是曾被认为仅由外泌体递送的RNA种类。
4.2 细胞摄取与受体识别：网格蛋白介导的内吞、巨胞饮及其他区别于经典EVs的途径
经典EVs通过多种途径被受体细胞内化，包括网格蛋白和陷穴蛋白介导的内吞、巨胞饮、吞噬、脂筏介导的内化、直接膜融合以及受体介导的识别。由于NVEPs缺乏脂质双分子层，它们无法利用膜融合，也不太可能参与磷脂酰丝氨酸（PS）依赖性识别，因此其摄取预计主要依赖内吞途径。研究表明，纳米颗粒的细胞摄取模式高度依赖其理化性质和受体细胞类型。对于较小的NVEPs或类似纳米结构，网格蛋白介导的内吞（CME）已被确认为关键进入途径。对于较大颗粒或具有非层状结构的颗粒，巨胞饮则占主导地位。此外，NVEPs的摄取受表面修饰和蛋白质冠的动态调控。需要强调的是，上述摄取途径的证据主要来自合成纳米颗粒和囊泡的研究，关于NVEPs是否采用相同内化途径的直接实验证据仍然缺乏。
4.3 下游效应机制：转录后调控、代谢重编程与信号转导
进入受体细胞后，NVEPs递送特定的蛋白质、RNA和代谢物货物，并触发一系列不同于传统EVs的下游生物学效应。在转录后调控层面，NVEPs携带的特异性RNA可直接调节靶基因表达。例如，进入CNS后，supermeres优先与小胶质细胞相互作用并抑制转化生长因子β1（TGFβ1）表达，从而调节免疫活性。在代谢调控方面，单剂量体内实验表明，癌症来源的supermeres可降低肝脏糖原和脂质水平。此外，NVEPs参与ECM重塑，supermeres富集相关成分，能够影响肿瘤微环境（TME）的物理特性。更重要的是，NVEP功能往往不依赖于经典膜受体信号级联，而是可能通过货物在细胞内的释放直接作用于转录机制或代谢酶系统。
4.4 对先前分配的外泌体功能的批判性再评估
随着高分辨率分离技术的发展，大量先前归因于外泌体的生物活性物质和功能可能实际上来源于NVEPs。首先，蛋白质组学和RNA测序数据显示，蛋白质和核酸在exomeres和supermeres中的富集程度超过先前仅对外泌体的认识，这意味着过去使用粗制“外泌体”制备物获得的功能表型可能主要由共分离的NVEPs驱动。其次，在疾病生物标志物领域，SECmeres携带的RNA在区分AD患者方面优于sEVs，且富集脑内皮细胞转录本，表明先前归因于“脑源性外泌体”的标志物信号可能实际上来源于这一非囊泡亚群。第三，在跨屏障递送方面，supermeres已被证明能以依赖其完整结构和RNA含量的方式穿过BBB，并在体内选择性积聚于胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤中，这一特性先前常被笼统归因于外泌体的天然归巢能力。
4.5 NVEPs与囊泡性EVs的协同与拮抗：整合调控模型
NVEPs和囊泡性EVs并非孤立运作，而是在细胞外空间中构成动态交互的整合调控网络。两者可能协同作用以维持组织稳态或促进疾病进展。例如，在TME中，EVs可促进血管生成和成纤维细胞转化，而supermeres等NVEPs则负责基质重塑和免疫调节，两者可能在时空上协调构建促肿瘤生态位。相反，NVEPs和EVs也可能参与竞争性拮抗或相互调节。已提出“纳米材料-EV调控轴”的概念，其中纳米材料（包括合成和内源性非囊泡颗粒）的理化性质可调节EV释放、货物富集和下游过程，而EVs反过来可内化纳米颗粒并触发氧化应激或炎症。此外，细胞密度已被证明影响EVs的扩散和内化，这种局部微环境效应可能也适用于NVEPs。
5. NVEPs在疾病背景中的证据
5.1 癌症：结直肠癌中的多组学证据与耐药性转移
在结直肠癌（CRC）研究中，NVEPs特别是supermeres已被证实携带独特的功能货物并介导关键恶性表型。研究表明，癌症来源的supermeres富集糖酵解酶、TGFBI、miR-1246、MET、GPC1和AGO2，这一货物谱与传统外泌体显著不同。在功能层面，CRC来源的supermeres可增加乳酸分泌并重塑肿瘤代谢微环境，并已被证实可转移对西妥昔单抗的耐药性。此外，培养系统的维度显著影响NVEPs的分子谱，无论使用何种分离方法，从3D中空纤维生物反应器培养中获得的exomeres和supermeres的蛋白质组学特征始终与2D培养条件下的不同。
5.2 神经系统：Supermeres的血脑屏障穿越行为及其与AD的关联
NVEPs在CNS疾病中的机制正逐渐从传统外泌体研究中剥离出来。凭借其完整结构和特异性RNA含量，supermeres已被证实能够穿越BBB，进入CNS后优先与小胶质细胞相互作用并抑制TGFβ1表达，从而调节小胶质细胞免疫活性。在AD病理背景下，supermeres被发现富集淀粉样前体蛋白（APP）。此外，新鉴定的SECmere亚群在人类大脑和血液中被发现，富集脑内皮细胞转录本并参与构成BBB，其携带的RNA在区分AD患者与健康对照方面比sEV RNA具有更高的区分能力。
5.3 代谢器官：Supermeres对肝糖原和脂质代谢的调节
初步证据表明，NVEPs特别是supermeres的作用可能不仅限于局部微环境，还可能延伸至远端器官。研究明确表明，体内给药后，癌细胞来源的supermeres显著降低肝脏脂质和糖原水平，表明NVEPs可作为肿瘤-肝脏代谢轴的效应分子，介导肿瘤诱导的全身代谢重编程。然而，必须强调的是，确认supermeres直接调节肝糖原和脂质代谢的证据目前主要来自单一研究。
5.4 生殖系统：胎盘来源Exomeres的研究空白与前景
与癌症和神经科学领域相比，NVEPs在生殖系统中的研究仍处于非常早期阶段，可用文献极为有限。文献检索未发现关于胎盘滋养层来源exomeres携带C19MC miRNAs的直接实证报告。尽管已建立了从细胞培养基和人血浆中依次分离exomeres和supermeres的整合方案，且Vesiclepedia数据库已纳入非囊泡颗粒数据，但在BeWo细胞系或胎盘滋养层中验证exomere介导的滋养层特异性C19MC miRNA转运的功能研究同样未见报道。这一状况恰恰反映了NVEP生殖生物学领域的研究空白和迫切需求。
6. 转化前景：生物标志物与治疗潜力
6.1 挖掘NVEP货物作为液体活检生物标志物：高丰度、强稳定性与无膜降解的优势
NVEPs作为液体活检生物标志物的潜力正逐渐被认识。其核心优势在于独特理化性质赋予货物分子的卓越稳定性和检测灵敏度。与传统EVs不同，exomeres和supermeres等NVEPs缺乏脂质双分子层，这一特征保护封装的生物活性分子免受膜降解酶的作用，使其在循环体液中保持更大完整性。研究表明，exomere封装的miRNAs即使在蛋白酶和表面活性剂处理后仍对核酸酶降解具有强耐受性，证实其作为高度稳定的非囊泡复合物的性质。此外，NVEPs富集多种先前归因于外泌体的蛋白质和RNA，在某些组分中的富集程度甚至超过传统EVs。例如，supermeres高度富集argonaute蛋白（AGO1和AGO2），并构成比sEVs或exomeres更大的细胞外RNA来源。
6.2 NVEPs作为药物递送载体：概念验证与设计原则展望
尽管NVEPs作为药物递送载体的直接研究仍处于起步阶段，但基于其生物学特性和纳米医学的一般原则，可以设想其独特的应用潜力和设计策略。NVEPs天然具备超小粒径和无膜结构，理论上可能比传统脂质体或EVs表现出更强的组织穿透能力，并可能具有类似supermeres穿越BBB等生理屏障的天然优势。在设计原则方面，切向流过滤（TFF）已被证明适用于规模化分离高纯度exomeres，且所得产物保留其天然RNAi蛋白复合物结构，这为开发基于NVEP的核酸药物递送平台奠定了工艺基础。借鉴合成纳米载体的经验，未来NVEP载体的设计可能需要结合表面工程修饰以增强靶向性或调节免疫原性。同时，必须仔细考虑非囊泡颗粒的潜在免疫风险，动物实验表明非PEG化纳米颗粒可诱导加速血液清除（ABC）现象。此外，鉴于NVEPs缺乏脂质膜，基于膜融合的传统载药策略可能不适用，需要探索基于蛋白质-RNA相互作用或静电吸附的新型载药机制，或采用与脂质纳米颗粒（LNPs）杂交的策略。
6.3 靶向NVEP生物发生或摄取途径的治疗策略
靶向NVEPs的生物发生或摄取途径是干预细胞间通讯的潜在新策略，但该领域仍面临机制理解不足的挑战。现有文献表明，exomeres和supermeres等NVEPs的生物发生仍是一个未解之谜，仅有间接线索，这与EVs相对明确的ESCRT依赖和ESCRT非依赖途径形成鲜明对比。在摄取机制方面，尽管特异性受体尚未完全鉴定，但已知纳米颗粒的内吞行为受粒径和表面性质调控，可能涉及CME或巨胞饮等区别于经典EVs的途径。任何此类阻断策略目前仍属推测性，取决于NVEP特异性表面标志物或受体的鉴定，以及NVEPs而非共分离囊泡确实传递病理信号的直接证据。此外，皂苷处理等理化方法已被证明可差异提取生物纳米颗粒的内容物，这为在不影响正常EV功能的情况下选择性破坏NVEPs提供了潜在方法学途径。
7. 理论争议、研究局限与未解问题
7.1 “非囊泡性”定义的模糊性与命名争议
尽管exomeres和supermeres等NVEPs的发现揭示了细胞间通讯的复杂性，但其定义和命名仍面临重大挑战。当前分类系统主要依赖操作性定义，NVEPs通过特定分离程序而非明确的生物发生机制或独特分子标志物来定义。这种基于分离的定义使得“非囊泡性”一词的边界固有模糊。不同实验室使用的分离参数差异可能导致所得组分异质性，从而破坏命名的统一性。此外，随着SECmeres等新亚型的发现，NVEPs的内部异质性进一步增加，使得现有的囊泡性与非囊泡性二元分类显得过于简单。MISEV指南试图标准化EVs与非囊泡颗粒的区分，但仍强调整合来源材料、分离方法和分子特征的多维操作性定义，反映了目前尚无单一物理或生物学标准能精确划定NVEPs的范围。
7.2 体外培养系统与体内生理环境之间的功能差异
当前绝大多数NVEP功能研究基于体外细胞培养系统，这些系统与复杂的体内生理环境存在显著差异，限制了结论的转化价值。研究表明，培养条件和纯化策略显著影响细胞外颗粒的货物组成，即使在标准化操作下，体外产生的exomeres和supermeres的蛋白质组学谱也可能无法完全代表其在组织或体液中的真实状态。此外，体外观察到的NVEPs摄取效率和下游信号激活通常在高浓度和短暴露的非生理条件下获得，可能夸大其生物学效应。相比之下，体内循环中的NVEPs面临核酸酶降解、免疫清除和血流剪切力等严峻挑战，其半衰期、靶向能力和实际递送效率可能与体外结果存在显著差异。
7.3 金标准参考物质缺失对定量研究的制约
NVEP研究的定量化因缺乏金标准参考物质而受到严重阻碍，这使得跨实验室数据比较和质量控制极为困难。与合成纳米颗粒或某些成熟的病毒载体不同，NVEPs表现出高异质性和不稳定性，目前尚无国际公认、严格表征的NVEP标准可用于校准分离效率、纯度评估或含量测定。现有测量技术在灵敏度和特异性方面均存在局限，例如纳米颗粒跟踪分析（NTA）对小于50 nm颗粒的检测能力有限，而质谱可提供蛋白质指纹但无法直接转换为颗粒数量。由于缺乏统一的定量基准，不同研究中报告的NVEPs产量、RNA载量和功能效力往往相差数个数量级，使文献的可重复性受到质疑。
7.4 数据库与注释系统缺失对机制分析的阻碍
与EV领域相对完善的数据库资源相比，NVEP特异性数据库和功能注释系统的极度匮乏严重限制了对其他分子机制的深入剖析。现有EV数据库主要包含基于脂质双分子层结构的囊泡分子信息，缺乏对非膜性NVEPs特有的蛋白质-RNA相互作用模式、非常规分泌信号和代谢物组合的专门注释条目。因此，在进行多组学数据分析时，研究人员只能借用EVs或细胞内复合物的注释框架，容易导致对NVEP特异性功能的误解或遗漏。此外，由于缺乏整合的NVEP知识库，不同研究中鉴定的潜在标志物难以系统交叉验证或进行功能关联分析，阻碍了从孤立分子发现向调控网络构建的转变。
8. 未来展望
NVEP研究正从发现阶段进入机制解析和转化探索阶段。未来工作需要针对NVEPs无膜和小尺寸的理化特性建立专门的技术和分析框架，一方面在单颗粒水平解析其异质性，另一方面通过国际合作建立标准化分离和表征程序以提高跨研究可重复性。
8.1 单颗粒分析与整合多组学技术的应用前景
鉴于NVEPs在尺寸、密度和分子组成上的高度异质性，批量分析往往掩盖关键亚群的功能特征。近期已有多种单颗粒平台可用，包括双色STORM测量冠厚度、三维单颗粒追踪、基于阻抗的亚微米流体分析和膜感应肽探针结合单分子阵列等。其中，无标记单颗粒平台被认为对NVEPs最有前景，因其不依赖抗体识别膜相关标志物，可直接兼容无膜颗粒。两个进一步发展方向应优先考虑：单颗粒多组学读出，以及AI辅助分类。
8.2 建立国际公认的NVEP分离与表征指南和质量控制标准
最紧迫的优先事项不是任何单一分离方法，而是建立NVEP特异性标准。整合的dUC-密度梯度方案和连续等电聚焦表明高纯度分离在技术上可行，正交纯度检测面板可立即实施。因此，应优先制定类似MISEV的共识，定义“非囊泡性”的操作含义以及exomeres和supermeres的边界，连同经过验证的标志物和阴性对照，而非进一步的方法增殖。自动化平台和NVEP适配系统只有在这样的框架内才能发挥其全部价值。
8.3 高分辨率时空图谱与原位功能解析
无法重现生理环境的体外研究难以反映NVEPs在体内的动态行为。NVEPs的功能再定义最终需要生理相关环境中获得的高分辨率时空证据。在现有策略中，活体成像结合基因编码标签被认为最有前景，因其可实现非破坏性、亚群特异性追踪，且不依赖与无膜颗粒不兼容的膜染料；组织透明化和光片显微镜可将这些轨迹扩展到全器官三维图谱。并行优先事项是验证从合成纳米颗粒推断的进入途径是否适用于真正的NVEPs，并考虑2D与3D培养条件等混杂因素。与单细胞转录组学和空间代谢组学的整合将把NVEP功能映射到特定细胞类型和解剖位置。
9. 结论
对NVEPs等非囊泡成分日益增长的关注正推动细胞外通讯研究走向更精细的分类和功能解析。NVEPs的发现不仅填补了细胞外颗粒谱系中小于50 nm非膜性成分的空白，也促使人们修正脂质双分子层是RNA在细胞外稳定存在的唯一载体形式的长期观点。从转化医学角度看，NVEPs的高丰度和货物稳定性，以及初步观察到的BBB穿越等组织穿透现象，为其作为液体活检生物标志物和递送载体的进一步研究提供了依据。然而，将这一潜力转化为临床获益需要承认当前局限，包括定义模糊、金标准缺失和体内功能验证不足。未来研究应整合三个迄今被分开探索的维度：真实NVEPs的结构表征、体内功能验证和生理相关实验环境。在技术创新和标准发展的双重驱动下，NVEPs的生物学身份可被彻底阐明，这不仅是对EV领域的补充，更是重新审视细胞间通讯物质基础的机会。
