TRRAP促进了依赖MBM蛋白的有丝分裂转录过程，并决定了细胞对CHK1抑制剂抑制作用的敏感性

《Cell Reports》：TRRAP enables MMB-dependent mitotic transcription and determines sensitivity to CHK1 inhibition

　　亮点：
- TRRAP占据MBB目标启动子并激活G2/M阶段的转录
- TRRAP促进CHK1i诱导的早期有丝分裂和DNA损伤
- YAP可以绕过G1阶段，但无法绕过TRRAP在G2/M阶段的依赖性

总结：
精确的时间调控有丝分裂基因对于细胞周期的正常进行至关重要，然而协调这一过程的染色质机制尚未完全了解。B-MYB-MuvB（MMB）复合体是有丝分裂基因表达的关键调节因子，在ATR-CHK1通路被抑制后，该复合体会过度激活，导致依赖MMB的早期有丝分裂、复制灾难和细胞死亡。在此研究中，我们结合了基于邻近性的蛋白质组学方法和使用CHK1抑制剂诱导的早期有丝分裂和DNA损伤作为功能读数的靶向siRNA筛选技术，确定了TRRAP作为依赖MMB的有丝分裂转录的关键调节因子。TRRAP与B-MYB物理结合，占据MBB目标启动子，并且在正常的G2/M阶段以及CHK1抑制剂诱导的早期有丝分裂过程中都对于有丝分裂基因的表达是必需的。尽管YAP信号通路的激活可以绕过G1阶段对TRRAP的需求，但TRRAP对于G2/M阶段的基因表达和有丝分裂进程仍然至关重要。这些发现将TRRAP依赖的染色质调控与MMB活性及检查点敏感性联系起来。

引言：
细胞周期的正确调控对正常发育至关重要。当这种调控受到破坏时，可能会导致癌症等疾病。转录活性的变化确保每个细胞周期阶段所需的蛋白质在适当的时间产生。在G1/S转换期间，E2F依赖的转录促进DNA复制，而在G2/M阶段，一组不同的基因达到峰值并编码有丝分裂所需的蛋白质。有丝分裂基因的表达主要由进化保守的MYBL2-MuvB（MMB）复合体和MMB-FOXM1复合体控制。根据其结合伙伴的不同，MuvB核心可以作为抑制因子或激活因子发挥作用。在静止细胞和早期G1阶段，MuvB与p107或p130及E2F4/DP1结合形成DREAM复合体，抑制细胞周期基因的表达；当细胞进入G2/M阶段时，MuvB从DREAM复合体中解离并与B-MYB（MYBL2）结合形成MMB复合体，激活有丝分裂和胞质分裂所需的基因。在S期，ATR-CHK1信号通路通过限制CDK活性和抑制CDC25A依赖的CDK1激活来防止早期有丝分裂的发生。这种检查点机制还抑制DNA复制期间的MMB依赖性转录，从而确保S期和有丝分裂之间的时间分离。在复制压力增加的条件下（如肿瘤细胞中常见的情况），CHK1活性变得至关重要。的药物抑制会导致S期MMB依赖性转录的异常激活，从而引发早期有丝分裂和DNA损伤。MMB活性是CHK1抑制剂在肿瘤细胞中发挥细胞毒性作用的前提，因为已知B-MYB或其他MMB组分的丢失会降低CHK1抑制剂的敏感性。

先前的功能性遗传学筛选主要关注长期CHK1或ATR抑制或内源性复制应力反应的调节因子。尽管MMB复合体在激活有丝分裂基因表达中起核心作用，但在急性检查点抑制期间介导有丝分裂基因激活的机制仍不明确。结构研究表明，MuvB具有内在的抑制活性，这来自于其结合和稳定启动子附近核小体的能力。根据这一模型，与B-MYB结合后，抑制作用得以缓解，可能是通过改变启动子附近的核小体组织实现的。另外，MuvB还可以作为支架，将共激活因子和共抑制因子招募到细胞周期基因的转录起始位点。最近的研究表明，YAP与MMB合作促进G2/M阶段的基因表达，这表明可能还需要其他染色质调节因子来完全激活这一过程。在这里，我们试图鉴定使MMB依赖性有丝分裂转录成为可能的染色质共因子。通过基于邻近性的蛋白质组学和针对染色质调节因子的siRNA筛选，我们确定TRRAP是MMB的关键共因子。急性蛋白质降解、染色质分析和转录组分析显示TRRAP在MMB目标基因处的富集，并证实TRRAP在MMB依赖性有丝分裂转录和细胞对CHK1抑制的敏感性中起重要作用。尽管YAP信号通路的激活可以绕过G1阶段对TRRAP的需求，但TRRAP对于G2/M阶段的基因表达和有丝分裂进程仍然至关重要。

结果：
- 通过邻近标记鉴定B-MYB相互作用蛋白
为了系统地鉴定可能与MMB介导的转录激活相关的新相互作用蛋白，我们使用了高活性的生物素连接酶BirA（R118G, BirA?）进行了邻近依赖性生物素标记（BioID）实验。当BirA?与诱饵蛋白融合时，它会在大约10纳米半径内的蛋白质赖氨酸残基上添加生物素（图1A）。随后通过链霉亲和素沉淀和质谱（MS）分析，可以识别出与诱饵紧密相邻的蛋白质，从而揭示感兴趣的蛋白质或复合体的相互作用组。

- 目标siRNA筛选鉴定MMB的染色质共因子
作为一种补充方法，我们进行了siRNA筛选，以鉴定MMB的染色质调节因子。在几种癌细胞系中，MMB复合体对于CHK1抑制的急性效应是必需的，包括早期有丝分裂及相关复制灾难和DNA损伤。之前的CRISPR和RNAi筛选是在长期CHK1/ATR抑制条件下进行的，用于鉴定长期存活或抗性的介质。在这里，我们利用CHK1抑制的急性反应作为MMB活性的功能读数。首先，我们通过siRNA介导的BirA枯竭实验确认了这些反应对MBM的依赖性，随后使用prexasertib处理A549肺腺癌细胞。通过EdU脉冲标记来检测S期细胞，并对DNA含量（Hoechst）、DNA损伤标志物γH2AX和有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3（pH3）进行染色。高内容单细胞显微镜技术用于定量S期细胞中的早期有丝分裂和DNA损伤。BirA?的枯竭减少了S期内由CHK1i诱导的DNA损伤和早期有丝分裂，证实了这些表型依赖于MBM。

- TRRAP在MMB依赖性有丝分裂转录和细胞对CHK1抑制敏感性中的关键作用
急性蛋白降解、染色质分析和转录组分析显示TRRAP在MMB目标基因处的富集，并确立了TRRAP在MMB依赖性有丝分裂转录和细胞对CHK1抑制敏感性中的必要性。此外，尽管YAP信号的激活可以绕过G1/S阶段对TRRAP的需求，但TRRAP对于MMB驱动的G2/M转录和有丝分裂进程仍然是必需的。依赖性评分的比较证实了跨细胞系的稳健关联（Pearson r = 0.35，p < 2.2 × 10^-16；图2G），这一关联也在多种肿瘤谱系中得到验证，包括脑癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌（图S2C）。逆向分析得出了类似的结果：当根据与TRRAP依赖性的相关性对基因进行排名时，MYBL2在全基因组中名列前茅（图S2D）。CRISPR-Cas9依赖性数据的分析也支持了这些结果，TRRAP是与MYBL2相关联的top基因之一（图2H和S2E-S2G）。这些数据集共同提供了TRRAP和MYBL2在癌细胞中存在功能关系的独立证据。

TRRAP与B-MYB发生物理相互作用，并且对于MMB依赖性的早期有丝分裂是必需的
为了验证BioID的结果并确认B-MYB与TRRAP之间的相互作用，我们使用了带有HA标签的B-MYB和带有Flag标签的TRRAP进行了共免疫沉淀（coIP）实验。TRRAP与B-MYB强烈共沉淀（图3A）。重要的是，内源性TRRAP也与B-MYB相互作用，确认了这一相互作用的生理相关性（图3B）。与NuA4/TIP60和STAGA的广泛关联一致，B-MYB还与RUVBL1和TAF5L共沉淀（图S3）。为了进一步绘制TRRAP与B-MYB之间的相互作用区域，我们使用一系列B-MYB缺失构建体进行了coIP实验（图3C）。TRRAP特异性地与B-MYB的C端区域（氨基酸411-700）相互作用，但与N端DNA结合域或转激活域没有相互作用（图3D）。包含氨基酸411-563的截短B-MYB构建体，该构建体缺乏负调控域（NRD）和MuvB结合域（MBD），足以使TRRAP结合。相反，删除氨基酸418-563会消除这种相互作用，证实这一区域对TRRAP的结合至关重要。综上所述，这些结果表明TRRAP结合到B-MYB的一个与DNA结合域、TAD域、NRD域和MBD域不同的区域。

图3 TRAP与B-MYB发生物理相互作用，并且对于MMB依赖性的有丝分裂激活是必需的
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(A) 在HEK293T细胞中进行的HA-BMYB和Flag-TRRAP的共免疫沉淀。裂解物用抗HA抗体免疫沉淀，并对Flag和HA进行免疫印迹。输入代表总裂解物的4%。
(B) 染色质片段中B-MYB与TRRAP的内源性相互作用。染色质提取物用抗B-MYB抗体或对照IgG免疫沉淀，并对TRRAP和B-MYB进行免疫印迹。输入代表总材料的1%。
(C) 用于相互作用绘图的B-MYB缺失构建体的示意图。DBD表示DNA结合域；TAD表示转激活域；NRD表示负调控域；MBD表示MuvB结合域。
(D) B-MYB中TRAP结合区域的绘制。Flag-TRRAP与图(C)中显示的带有HA标签的B-MYB缺失突变体共表达。HA-BMYB被免疫沉淀并对HA和Flag进行免疫印迹。输入代表总裂解物的4%。
(E) 使用siRNA抗性的B-MYB构建体进行的拯救实验。表达野生型B-MYB、MuvB结合缺陷突变体（Q674A, M677A）或TRAP结合缺陷突变体（Δ418-563）的细胞在去除内源性B-MYB后被分析其早期有丝分裂和DNA损伤情况。数据显示为平均值±标准差。双因素ANOVA（n = 3）。

为了确定B-MYB与TRRAP之间的物理相互作用是否对 CHK1抑制后的DNA损伤和早期有丝分裂表型有关，我们使用了B-MYB突变体进行了拯救实验。我们建立了表达野生型B-MYB、MuvB结合缺陷突变体（Q674A, M677A）或缺失TRAP结合区域的缺失突变体（Δ418-563）的细胞系（图3E）。所有构建体都含有使它们抵抗siRNA介导的内源性B-MYB清除的沉默突变。去除内源性B-MYB后，只有野生型B-MYB能够拯救CHK1抑制剂诱导的早期有丝分裂和DNA损伤表型。相比之下，MuvB结合缺陷突变体和TRAP结合缺陷突变体都无法做到这一点（图3E）。这些数据共同表明，B-MYB上的TRAP结合区域对于CHK1抑制引起的MMB依赖性早期有丝分裂进入是必需的。

TRRAP的急性降解抑制了CHK1i诱导的早期有丝分裂和DNA损伤
基于siRNA的方法的一个限制是需要较长时间才能实现有效的降解，这阻碍了研究TRAP丢失的短期效应。为了克服这一限制，我们建立了一个利用auxin诱导的degron（mAID）系统，在A549细胞中快速降解TRAP（图4A）。通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，我们将mAID-HA degron cassette插入内源性TRAP位点内（图S4A和S4B）。由于mAID系统需要植物F box蛋白OsTIR1进行auxin依赖性的泛素化，我们通过慢病毒转导将优化的突变体TIR1-F74G引入编辑后的A549细胞。添加auxin类似物5-Ph-IAA后，TIR1-F74G将mAID-HA标签的TRAP招募到SCF复合体中，触发融合蛋白的快速蛋白酶体降解。Western印迹分析证实，5-Ph-IAA处理在4小时内降低了TRAP水平，并在6小时内几乎完全将其降解（图4B）。免疫染色验证了HA标签的TRAP位于细胞核中，并在5-Ph-IAA处理6小时后丢失（图S4C）。

图4 TRAP的急性降解抑制了CHK1i诱导的早期有丝分裂和DNA损伤
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(A) auxin诱导的degron（AID）系统用于TRAP的急性降解的示意图。添加5-Ph-IAA促进TIR1（F74G）介导的内源性mAID标签TRAP的泛素化和蛋白酶体降解。
(B) 在1 μM 5-Ph-IAA处理后在指定时间点对HA-TRAP进行免疫印迹的结果。
(C和D) 在有无CHK1i处理的情况下，TRAP降解后pH3阳性（C）和γH2AX阳性（D）S期细胞的定量。数据显示为平均值±标准差。双因素ANOVA（n = 3）。
(E和F) 在5-Ph-IAA和CHK1i处理后对HA-TRAP和磷酸化KAP1（E）或lamin A/C（F）进行免疫印迹分析。肌动蛋白作为加载对照。
(G和H) 在加入指定浓度的NU9056后，有无CHK1i处理的情况下，pH3阳性（G）和γH2AX阳性（H）S期细胞的定量。数据显示为平均值±标准差。双因素ANOVA（n = 3）。
(I) 在有或没有5-Ph-IAA的情况下，用逐渐增加浓度的CHK1i处理A549 mAID-TRAP细胞的存活率。数据显示为平均值±标准差（n = 3）。使用额外的平方和F检验进行非线性回归。

利用这个系统，我们首先研究了TRAP急性丢失对细胞周期分布的影响。TRAP降解4到10小时后，G1期细胞的比例略有增加，S期细胞的比例减少，而G2/M期细胞群体基本保持不变（图S4D）。短期CHK1抑制（2小时），无论是单独使用还是与TRAP降解结合使用，都没有显著改变细胞周期分布，这与之前的报告一致。

TRAP缺失仅持续4小时就减少了CHK1抑制2小时后的pH3阳性S期细胞数量，在10小时后效果更明显，证实TRAP对于CHK1i诱导的早期有丝分裂进入是必需的（图4C）。γH2AX染色显示，在TRAP缺失6小时后，γH2AX阳性S期细胞显著减少，在10小时后进一步减少（图4D）。一致的是，对ATM介导的双链断裂反应的标志物KAP1的磷酸化染色显示，CHK1i诱导的DNA损伤依赖于TRAP（图4E）。对立层A/C的磷酸化染色（S22是mitotic CDK1活性的直接底物）证实，在TRAP缺失的细胞中，CHK1抑制后的CDK1激活显著减少（图4F）。

为了控制auxin系统的潜在影响，我们用5-Ph-IAA处理了表达TIR1-F74G但缺乏mAID标签TRRAP的亲本A549细胞。这些对照细胞用5-Ph-IAA处理后，没有减少CHK1i诱导的早期有丝分裂或DNA损伤（图S4E），这表明观察到的表型是由TRAP的急性降解而非auxin处理或TIR1表达引起的。

由于TRAP是NuA4/TIP60复合体的核心组成部分，我们接下来询问TIP60的催化活性是否对CHK1抑制反应有贡献。使用选择性TIP60抑制剂NU9056处理后，CHK1i诱导的早期有丝分裂和DNA损伤以剂量依赖的方式减少，表现出与TRAP缺失相似的效果（图4G和4H）。重要的是，24小时的NU9056处理并没有显著改变整体细胞周期分布（图S4F），这排除了将这些效果归因于非特异性细胞周期停滞的可能性。综合这些结果，支持TIP60/NuA4活性对TRAP依赖性的检查点反应有功能贡献。

最后，鉴于TRAP缺失减弱了CHK1i诱导的DNA损伤，我们测试了其对细胞存活的影响。TRAP缺失的细胞在增加剂量的CHK1抑制剂prexasertib处理后表现出更高的存活率（图4I）。这些结果共同表明，TRAP促进了早期有丝分裂的进入和DNA损伤，从而使细胞对CHK1i处理更加敏感。

TRAP在S期介导MMB依赖性的有丝分裂基因表达
为了研究TRAP是否对于S期有丝分裂转录程序的早期激活是必需的，我们进行了RNA测序。细胞从G1/S期释放到S期1小时，然后进行3小时的CHK1抑制剂（CHK1i）处理（图5A）。通过在释放前2小时添加5-Ph-IAA来诱导TRAP降解，并持续6小时，确保已经进入S期的细胞中TRAP被充分降解。这种方法避免了在G1/S转换期的间接影响，因为在该阶段TRAP对于E2F和MYC依赖性的转录是必需的。重要的是，EdU染色证实TRAP缺失和对照细胞之间的S期重新进入相当，Western印迹验证了HA-TRAP的有效降解，而B-MYB蛋白水平保持不变（图5B和5C）。

图5 TRAP在S期促进MMB依赖性的有丝分裂基因表达
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(A) RNA-seq的实验设计。细胞在G1/S边界处同步，释放到S期，然后用5-Ph-IAA和/或CHK1抑制剂（CHK1i）处理，并收获用于RNA分离。
(B) 从G1/S期释放后，对照细胞和5-Ph-IAA处理细胞的EdU掺入情况（n = 2）。
(C) 在5-Ph-IAA处理后S期的HA-TRAP和B-MYB的免疫印迹分析。Vinculin作为加载对照。
(D) 在CHK1抑制后S期差异表达基因的火山图。显著上调和下调的基因被标记出来（log2倍数变化>0.5，FDR <0.05；n = 3）。
(E) CHK1抑制后MMB靶基因的表达变化（n = 265）。
(F) 在TRAP急性缺失后S期的差异表达基因的火山图（n = 3）。
(G) TRAP缺失后top 100个富集基因集的GSEA分析。
(H) TRAP缺失后MMB靶基因（n = 265）和G1/S基因的表达变化。
(I) CHK1抑制、TRAP缺失或联合处理后MMB靶基因的log2倍数变化。成对Wilcoxon符号秩检验。
(J) 在指定条件下Z-score标准化的MMB靶基因的表达热图。
(K) 以de novo TRAP峰值为中心的RPGC标准化的IgG和HA-TRAP CUT&RUN信号的热图（n = 8,759）。信号在两个生物学重复样本中取平均值。
(L) 在(K)中显示的峰值上的平均CUT&RUN谱型。
(M) 以MMB靶基因转录起始位点为中心的RPGC标准化的IgG和HA-TRAP CUT&RUN信号的热图（n = 279）。
(N) 在(M)中显示的启动子上的平均CUT&RUN谱型。
(O) 在CHK1抑制、TRAP缺失或联合处理后，对选定的G2/M基因进行RT-qPCR分析。数据显示为平均值±标准差（n = 4）。单因素ANOVA。

CHK1在S期的抑制导致298个基因上调和287个基因下调（log2FC > 0.5，FDR <0.05）（图5D）。在265个表达的MMB靶基因中，有69个基因显著上调，表明MMB依赖性的有丝分裂转录程序被提前激活，而G1/S相关基因则下调（图5E和S5A–S5C）。相比之下，TRAP在S期的降解导致γH2AX阳性S期细胞显著减少，在10小时后进一步减少（图4D）。一致的是，对KAP1的磷酸化染色显示，CHK1i诱导的DNA损伤依赖于TRAP（图4E）。对立层A/C在S22处的磷酸化染色证实，在TRAP缺失的细胞中，CDK1的激活显著减少（图4F）。

为了控制auxin系统的潜在影响，我们用5-Ph-IAA处理了表达TIR1-F74G但缺乏mAID标签TRRAP的亲本A549细胞。对这些对照细胞进行5-Ph-IAA处理后，没有减少CHK1i诱导的早期有丝分裂或DNA损伤（图S4E），表明观察到的表型是由TRAP的急性降解而不是auxin处理或TIR1表达引起的。

由于TRAP是NuA4/TIP60复合体的核心组成部分，我们接下来询问TIP60的催化活性是否对CHK1抑制反应有贡献。使用选择性TIP60抑制剂NU9056处理后，CHK1i诱导的早期有丝分裂和DNA损伤以剂量依赖的方式减少，模仿了TRAP缺失的效果（图4G和4H）。重要的是，24小时的NU9056处理并没有显著改变整体细胞周期分布（图S4F），这排除了这些效果是由非特异性细胞周期停滞引起的解释。综上所述，这些结果支持TIP60/NuA4活性对TRAP依赖性的检查点反应有功能贡献。

最后，鉴于TRAP缺失减弱了CHK1i诱导的DNA损伤，我们测试了其对细胞存活的影响。TRAP缺失的细胞在增加剂量的CHK1抑制剂prexasertib处理后表现出更高的存活率（图4I）。这些结果共同表明，TRAP促进了早期有丝分裂的进入和DNA损伤，从而使细胞对CHK1i处理更加敏感。

TRAP在S期介导MMB依赖性的有丝分裂基因表达
为了研究TRAP是否对于S期有丝分裂转录程序的早期激活是必需的，我们进行了RNA测序。细胞从G1/S期释放到S期1小时，然后进行3小时的CHK1抑制剂（CHK1i）处理（图5A）。通过在释放前2小时添加5-Ph-IAA来诱导TRAP降解，并维持总共6小时，确保已经进入S期的细胞中的TRAP被充分降解。这种方法避免了在G1/S转换期的间接影响，在该阶段TRAP对于E2F和MYC依赖性的转录是必需的。重要的是，EdU染色证实TRAP缺失和对照细胞之间的S期重新进入相当，Western印迹验证了HA-TRAP的有效降解，而B-MYB蛋白水平保持不变（图5B和5C）。

图5 TRAP在S期使MMB依赖性的有丝分裂基因表达成为可能
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(A) RNA-seq的实验设计。细胞在G1/S边界处同步，释放到S期，用5-Ph-IAA和/或CHK1抑制剂（CHK1i）处理，然后收获用于RNA分离。
(B) 从G1/S期释放后对照细胞和5-Ph-IAA处理细胞的EdU掺入情况（n = 2）。
(C) 在5-Ph-IAA处理后S期的HA-TRAP和B-MYB的免疫印迹分析。Vinculin作为加载对照。
(D) 在CHK1抑制后S期差异表达基因的火山图。显著上调和下调的基因被标记出来（log2倍数变化>0.5，FDR <0.05；n = 3）。
(E) CHK1抑制后MMB靶基因的表达变化（n = 265）。
(F) 在TRAP急性缺失后S期的差异表达基因的火山图（n = 3）。
(G) 在TRAP缺失后MMB靶基因的基因集富集分析（GSEA）。
(H) TRAP缺失后MMB靶基因（n = 265）和G1/S基因的表达变化。
(I) CHK1抑制、TRAP缺失或联合处理后MMB靶基因的log2倍数变化。成对Wilcoxon符号秩检验。
(J) 在指定条件下Z-score标准化的MMB靶基因的表达热图。
(K) 以de novo TRAP峰值为中心的RPGC标准化的IgG和HA-TRAP CUT&RUN信号的热图（n = 8,759）。信号在两个生物学重复样本中取平均值。
(L) 在(K)中显示的峰值上的平均CUT&RUN谱型。
(M) 以MMB靶基因转录起始位在预定义的MMB靶标启动子中也观察到了类似的模式（图S5J）。总体而言，这些发现表明，TRRAP的转录效应并非主要通过降低B-MYB/MMB成分的表达或染色质招募来介导的。值得注意的是，TRRAP的缺失减弱了CHK1i诱导的MMB靶标的表达，这表明TRRAP对于响应CHK1抑制而激活有丝分裂转录程序是必需的（图5I）。相比之下，TRRAP降解对G1/S相关基因的影响远不如对MMB靶标的影响明显（图S5K）。热图进一步说明了TRRAP缺失和CHK1抑制在S期对有丝分裂基因表达的相反效应（图5J）。显示TRRAP依赖性CHK1i诱导的代表性基因包括CCNB1、PLK1和CDC20。接下来，我们探讨了TRRAP本身是否与B-MYB结合的染色质以及MMB调控的位点相关。使用HA抗体在mAID-HA-TRRAP A549细胞中进行CUT&RUN分析后，通过重新采样峰值检测识别出8,759个TRRAP峰值（MACS2，q < 0.05）（图S6A；表S7）。相当一部分TRRAP峰值位于启动子区域（图S6B）。RPGC标准化的HA-TRRAP信号高于IgG信号，并且在两次生物学重复实验中5-Ph-IAA处理后均有所降低（图5K、5L、S6C、S6D、S7A和S7B；表S7）。即使在CHK1抑制的情况下，急性TRRAP降解也会减少TRRAP CUT&RUN信号，而单独的CHK1抑制在两次生物学重复实验中的效果则不那么一致（图5K、5L、S6D、S7A和S7B）。与独立识别的B-MYB pT487峰值集比较后，发现了2,694个重叠的基因组区域，分别占TRRAP峰值的30.8%和B-MYB pT487峰值的27.1%（图S7C）。这些共享的峰值包括49个独特的、高置信度的MMB靶标启动子（定义为距注释的TSS±1 kb）。TRRAP CUT&RUN信号在B-MYB pT487峰值周围增强，并且在TRRAP降解后减弱（图S7D）。值得注意的是，在B-MYB pT487信号较高的区域，TRRAP信号更强（图S7D）。接下来，我们研究了TRRAP的 Occupancy是否优先与MMB调控的基因相关。TRRAP峰值在MMB靶标基因的启动子处显著富集（图S6E）。一致地，TRRAP CUT&RUN信号在279个高置信度MMB靶标基因的TSS周围富集，并且在TRAP降解后减弱（图5M、5N、S8A和S8B；表S8）。代表性的基因组浏览器轨迹进一步展示了在生长素诱导的降解后HA-TRRAP在各个MMB靶标启动子的富集情况（图S8C）。这些分析共同确定了TRRAP和B-MYB pT487峰值集的重叠部分，并支持HA-TRRAP在MMB依赖性转录中的重要作用。为了验证这些发现，我们对单个MMB靶标基因进行了RT-qPCR分析。细胞被诱导进入S期，并在RNA测序的相同条件下用5-Ph-IAA处理。急性TRRAP缺失阻止了包括CCNB1和CDC20在内的G2/M基因的CHK1i诱导的活化（图5O）。同样，siRNA介导的B-MYB或TRRAP的缺失也取消了S期MMB靶标的CHK1i诱导上调（图S9A–S9C）。综上所述，这些数据表明TRRAP对于S期MMB依赖性有丝分裂基因的表达是必需的。虽然CHK1抑制会诱导这些靶标的早期表达，但TRRAP的缺失在很大程度上阻止了这种反应，表明TRRAP作为关键辅因子，在CHK1抑制后促进MMB依赖性基因的活化。

TRRAP对于独立于检查点抑制的MMB依赖性G2/M进程也是必需的。为了确定TRAP是否在CHK1抑制之外的情况下也对于MMB依赖性有丝分裂基因表达是必需的，我们在第二个细胞背景下研究了其功能。我们生成了表达YAP constitutively active 突变的mAID-TRRAP knock-in MCF10A细胞，YAP是一种转录共激活因子和Hippo信号通路的下游效应器。YAP5SA是一种 constitutively active 的YAP突变体，因为它不能被Hippo激酶抑制。YAP通过与B-MYB结合增强染色质结合来激活G2/M基因表达，并通过缩短G1期来促进细胞周期进程。通过免疫印迹证实了在5-Ph-IAA处理下mAID-TRRAP的有效降解以及多西环素诱导的YAP5SA的活化（图6A）。在缺乏YAP5SA的对照MCF10A细胞中，TRRAP缺失在24小时内导致了明显的G1期停滞（图6B）。相比之下，表达YAP5SA的细胞对这种G1期停滞具有很强的抵抗力。相反，长期TRAP缺失导致细胞在G2/M期显著积累，表明致癌的YAP可以绕过G1期对TRAP的需求，但不能绕过其在细胞周期后期的功能（图6B）。

图6 显示了YAP在表达细胞中TRAP对G2/M进程的必要性。完整Caption：
(A) 免疫印迹确认了多西环素诱导的YAP5SA表达以及5-Ph-IAA处理后mAID标记的TRRAP降解。Vinculin作为加载对照。
(B) TRAP缺失后对照和表达YAP5SA的MCF10A细胞的细胞周期分布。数据以平均值±标准差表示（n = 3）。
(C) TRAP缺失后磷酸化RB（pRB）/总RB比值的量化。展示了一个代表性实验（n = 2）。
(D) 转染了对照或WEE1 siRNA并经过5-Ph-IAA处理的表达YAP5SA的细胞的细胞周期分布。数据以平均值±标准差表示（n = 3，单因素方差分析）。
(E) TRAP缺失和/或WEE1敲低后pH3阳性G2/M细胞的量化。数据以平均值±标准差表示（n = 3，单因素方差分析）。
(F) TRAP缺失后γH2AX阳性S期细胞的量化。数据以平均值±标准差表示（n = 3，单因素方差分析）。
(G 和 H) TRAP缺失和YAP5SA表达后选定的G1/S (G) 和 G2/M (H) 基因的RT-qPCR分析。数据以平均值±标准差表示（n = 3，双因素方差分析）。
(I) 通过EdU脉冲追踪分析测量的S期到M期持续时间。来自两个生物学重复实验的平均值。
(J) 在有或没有TRAP缺失的情况下，表达YAP5SA的细胞中cyclin B1表达的免疫荧光时间进程分析。来自两个生物学重复实验的平均值。
(K) 在有或没有YAP5SA的情况下，TRAP缺失后cyclin B1阳性细胞的量化。来自两个生物学重复实验的平均值。
(L) 用不同浓度的CDK1抑制剂RO3306处理的表达YAP5SA的MCF10A细胞的细胞周期分布。数据以平均值±标准差表示（n = 3，单因素方差分析）。

为了确定这种表型是否仅限于constitutive YAP5SA表达，我们使用LATS抑制剂激活了MCF10A细胞中的内源性YAP/TAZ信号。LATS抑制同样促进了TRAP缺失细胞在G2/M期的积累，尽管效果不如YAP5SA表达时那么明显（图S10A）。这些数据表明，在TRAP缺失后观察到的G2/M积累并不限于YAP5SA过表达系统。与这种解释一致，TRAP缺失导致对照细胞中的RB磷酸化几乎完全丧失，与G1期停滞相吻合，而表达YAP5SA的细胞保持了与对照组相当的RB磷酸化水平（图6C）。这些发现支持YAP5SA通过维持CDK4/6活性和通过限制点来补偿TRAP在G1期的特异性转录功能的观点。TRAP缺失后表达YAP5SA的细胞在G2/M期的积累可能是由于有丝分裂基因表达减少，或者是由于G2/M DNA损伤检查点的激活和WEE1对CDK1的抑制性磷酸化。为了区分这两种可能性，我们通过RNAi去除了WEE1。如果TRAP缺失会导致检查点介导的G2期停滞，那么WEE1缺失应该能够绕过这种停滞并恢复进入有丝分裂的过程。然而，WEE1的缺失未能恢复G2/M积累或恢复有丝分裂进入，这通过磷酸化组蛋白H3（pH3）染色来测量（图6D和6E）。此外，TRAP缺失在S期没有诱导可检测的DNA损伤，这也支持了不是检查点介导的细胞周期停滞的观点（图6F）。接下来，我们研究了选定的细胞周期基因的表达。虽然YAP5SA强烈诱导了G1/S和G2/M基因，但TRAP缺失降低了所有测试靶标的表达（图6G和6H）。在表达YAP5SA的细胞中，TRAP缺失后G1/S基因的表达部分得到保留，接近于不表达YAP5SA的细胞的基础水平。相比之下，在对照和表达YAP5SA的细胞中，G2/M基因都显著降低到相似的低水平，表明YAP5SA无法补偿TRAP缺失对有丝分裂转录的激活。与这些转录效应一致，TRAP缺失阻碍了从S期到有丝分裂的进程（图6I）。虽然YAP5SA表达本身不改变S-M阶段的时间，但TRAP缺失延缓了有丝分裂的进入，当TRAP缺失与YAP5SA表达结合时，缺陷最为明显。TRAP缺失还导致cyclin B表达减少，这与YAP5SA的状态无关，证实TRAP不仅对于CCNB1的转录是必需的，也对cyclin B蛋白的积累是必需的（图6J和6K）。最后，CDK1的藥理抑制再现了TRAP缺失时观察到的G2/M积累现象。用CDK1抑制剂RO3306处理表达YAP5SA的MCF10A细胞导致了类似的G2期停滞，支持TRAP对于适当CDK1激活和及时有丝分裂进入的必要性。为了确定这些发现是否不仅限于MCF10A细胞，我们生成了携带内源性mAID标记TRAP等位基因的HepG2肝癌细胞（图S10B和S10C）。选择HepG2细胞是因为已知肝细胞肿瘤发生依赖于YAP/TAZ信号通路。在HepG2细胞中，单独急性降解TRAP对细胞周期分布只有轻微影响（图S10D）。然而，siRNA介导的YAP/TAZ与TRAP联合缺失导致细胞在G1期积累。相反，使用LATS抑制剂激活内源性YAP促进了TRAP降解细胞在G2/M期的强烈积累，类似于在表达YAP5SA的MCF10A细胞中观察到的表型。总之，这些数据表明，尽管致癌的YAP可以绕过TRAP在G1期的特异性需求，但TRAP对于MMB依赖性的G2/M基因表达和有丝分裂进程仍然是必需的。这确立了TRAP作为MMB依赖性有丝分裂转录的关键辅因子。

MMB复合体是G2/M基因表达和有丝分裂进入的中心调节器，但其转录活性如何与染色质调控耦合尚不清楚。我们的发现确立了TRAP作为MMB依赖性有丝分裂转录的关键辅因子。我们证明了B-MYB与TRAP物理结合，并且TRAP在正常细胞周期进程和CHK1抑制期间都促进了G2/M基因的激活。这些结果支持了一个模型，即解除MuvB介导的抑制不仅通过核小体组织的结构变化实现，还需要包含TRAP的染色质调节复合物的活性。与此模型一致的是，TRAP在MMB靶标启动子处富集，对其转录激活是必需的，并促进了CHK1i诱导的有丝分裂基因表达。此外，TIP60的藥理抑制再现了TRAP缺失的效果，支持NuA4/TIP60通路的功能贡献。TRAP的急性缺失既不改变MYBL2和MuvB/DREAM复合体的表达，也没有伴随B-MYB pT487 CUT&RUN信号的明显减少，表明TRAP作用于MMB染色质招募之后。尽管TRAP以前在几种情况下与有丝分裂基因表达有关，但我们的数据通过将TRAP直接与MMB依赖性转录控制联系起来，提供了机制上的解释。ATR-CHK1通路在防止S期有丝分裂程序的提前激活中起着关键作用。在基础条件下，CHK1活性限制了CDK的激活，从而限制了MMB依赖性转录，确保了DNA复制和有丝分裂之间的分离。CHK1的藥理抑制破坏了这种协调，导致有丝分裂基因的提前激活、有丝分裂的提前进入和广泛的DNA损伤。我们的数据确定TRAP是这种异常有丝分裂转录的关键辅因子。TRAP的急性降解抑制了CHK1抑制剂诱导的有丝分裂基因表达和DNA损伤。重要的是，CHK1抑制的细胞毒性效应主要限于肿瘤细胞，这些细胞通常经历较高的内源性复制压力，并严重依赖ATR-CHK1信号通路生存。相比之下，非转化细胞通常能够耐受短暂的CHK1抑制而不进入有丝分裂，反映出较低的基础复制压力和完整的检查点冗余。DepMap依赖性数据集的分析确认了TRAP和B-MYB之间的强相关性，无论是在RNAi还是CRISPR筛选中，都支持TRAP和MMB复合体在癌细胞中的功能联系。TRAP已被广泛关联到E2F-和MYC依赖性转录，并被认为是G1/S基因表达和细胞周期进入的关键辅因子。与非转化的MCF10A细胞中的TRAP缺失导致G1/S停滞一致，TRAP缺失在非转化细胞中引起了G1/S的停滞。值得注意的是，通过表达YAP5SA或药理学抑制LATS激酶来激活YAP信号通路，可以绕过由TRRAP缺失引起的G1期停滞，并且在G2/M期进展过程中显示出对TRRAP的需求。在具有内源性YAP/TAZ信号通路的HepG2细胞中也获得了类似的结果：在TRRAP降解后，YAP的激活促进了G2/M期的积累；而在TRRAP丢失时，YAP的缺失加剧了G1期的停滞。这些观察结果表明，TRRAP缺失对细胞周期的影响在很大程度上取决于YAP的活性。即使在表达致癌性YAP的细胞中，G2/M期基因的表达仍然依赖于TRRAP。这些发现指出了早期与晚期细胞周期基因调控机制的差异。

总结来说，我们的研究结果支持这样一个模型：MBM靶基因的激活不仅需要解除MuvB介导的抑制，还需要含有TRRAP的染色质调控复合物的活性。这种机制在复制压力或检查点抑制的条件下尤为重要，而这种情况在肿瘤细胞中很常见。通过将染色质调控、复制压力和有丝分裂基因表达联系起来，TRRAP代表了一个可以在癌症治疗中加以利用的关键脆弱点。

**研究的局限性**
我们的研究确立了TRRAP作为MBM依赖性有丝分裂转录的关键共因子，并证明了TRRAP在MBM靶基因上的占据情况。然而，TRRAP促进转录的具体染色质机制仍有待明确。尽管药理学抑制TIP60可以再现TRRAP缺失的多种效应，但我们并未直接评估MBM靶位点上组蛋白乙酰化的变化，也未确定TRRAP如何影响相关染色质修饰复合物的募集和活性。未来的研究将需要确定TRRAP占据与转录激活之间的分子联系。此外，尽管YAP信号通路的激活可以克服TRRAP缺失引起的G1期停滞，并在G2/M期进展过程中显示出对TRRAP的需求，但这种 bypass 的分子基础仍然不清楚。未来的研究将进一步探讨YAP依赖性转录如何在早期细胞周期进展过程中补偿TRRAP的缺失，以及是否存在不同的共激活因子或染色质调控途径介导这种效应。

**资源可用性**
如需更多信息和资源，请联系主要联系人Stefan Gaubatz（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究中生成的所有独特试剂均可从主要联系人处获得，前提是签订了完整的材料转移协议。

**数据和代码可用性**
RNA测序和CUT&RUN数据集可在NCBI的基因表达组数据库（GEO:GSE318655）中找到。质谱数据已存储在MassIVE库中（MassIVE:MSV000102991）。本文未报告原始代码。如需重新分析本文中的数据，可向主要联系人请求额外信息。

**致谢**
本工作得到了德国研究基金会（DFG）的资助（GA 575/10-1+2（资助S.G.）、440766788（INST 93/1023-1-FUGG）、512024179（INST 93/1114-1 FUGG）、TRR387/1-514894665（资助E.W.）、EY 120/9-1和EY120/10-1（资助B.v.E.）、德国癌症援助组织的资助（TACTIC-70115201（资助E.W.）、70116078（资助B.v.E.）以及莱布尼茨合作卓越计划K398/2021（资助B.v.E.）的支持。同时，也非常感谢FLI的蛋白质组学设施的协助。

**作者贡献**
F.L.、D.G.、D.B.M.、L.B.、W.B.、P.K.、L.W.、A.-S.H.和G.W.进行了实验。C.S.-V.进行了高内涵显微镜分析。C.P.A.进行了下一代测序。S.G.进行了生物信息学分析。B.v.E.、E.W.和M.E.提供了必要的资源。S.G.规划了研究，监督了实验并撰写了论文。

**利益声明**
作者声明没有竞争利益。

**写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的情况**
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来改进语言、语法和可读性。作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

**方法**
**关键资源表**
**试剂或资源**
**来源与标识符**
抗 Betac-Actin 单克隆抗体：Santa Cruz Biotechnology（Cat# sc-47778；RRID: AB_626632）
抗 B-MYB 单克隆抗体（克隆 LX015.1）：Roger Watson
抗 B-MYB 单克隆抗体（pT487）：Abcam（Cat# ab-76009；RRID:AB_1309969）
抗 FLAG M2 单克隆抗体：Sigma-Aldrich（Cat# F3165；RRID: AB_259529）
抗 Vincin 学单克隆抗体：Sigma-Aldrich（Cat# V9131；RRID: AB_477629）
抗 Cyclin B 多克隆抗体：Santa Cruz（Cat# sc-752；RRID:AB_2072134）
抗 HA.11 单克隆抗体（克隆 16B12）：Covance（Cat# MMS-101；RRID:AB_291261）
抗 HA 单克隆抗体（ChIP Grade）：Abcam（Cat# ab9110；RRID: AB_307019）
抗 pH2A.X（Ser139）单克隆抗体：Santa Cruz（Cat# sc-517348；RRID:AB_2783871）
抗 pKAP1（S824）单克隆抗体：Abcam（Cat# ab70369；RRID:AB_1209417）
抗 pLAMIN A/C（Ser22）单克隆抗体：Cell Signaling（Cat# 13448；RRID:AB_2798221）
抗 YAP 单克隆抗体：Santa Cruz Biotechnology（Cat# sc-101199；RRID: AB_1131430）
抗 RB 单克隆抗体：BD Pharmingen（Cat# 554136；RRID:AB_395259）
抗 pRB（S807/S811）单克隆抗体：Cell Signaling（Cat# 8516S；RRID:AB_11178658）
化学品、肽和重组蛋白：
5-Ph-IAA：Sigma-Aldrich（Cat# SML3574）
多西环素盐酸盐：Sigma-Aldrich（Cat# D9891）
生物素：Sigma-Aldrich（Cat# B4501）
普雷克萨替布二盐酸盐（CHK1抑制剂）：Hycultec（Cat# HY-18174）
氢化可的松：Sigma-Aldrich（Cat# H0888）
霍乱毒素：Enzo Life Science GmbH（Cat# BML-G117）
胰岛素：Sigma-Aldrich（Cat# I9278）
重组人EGF：Sigma-Aldrich（Cat# E96445）
乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）：Jena Bioscience（Cat# CLK-N001）
RO-3306（CDK1抑制剂）：Sigma-Aldrich（Cat# SML0569）
blastidin S：Invivogen（Cat# ant-bl-1）
氢化霉素B：Sigma-Aldrich（Cat# H7772）
NU9056（TIP60抑制剂）：Sigma-Aldrich（Cat#: 5005110001）
TDI-011536（LATSi抑制剂）：Hycultec（Cat#: HY-150042）

**实验模型**
**细胞系**
MCF10A-YAP5SA：von Eyss等人（N/A）
A549：ATCC（Cat# CCL-185；RRID:CVCL_0023）
HEK293T：ATCC（Cat#CRL-3216；RRID: CVCL_0063）
A549-mAID-TRRAP：N/A
HepG2-mAID-TRRAP：N/A

**寡核苷酸**
DNA寡核苷酸和siRNA序列列于表S5中。

**重组DNA**
psPAX2：Addgene（Cat# 12260；RRID>Addgene_12260）
pCMV-VSV-G：Addgene（Cat# 8454；RRID:Addgene_8454）
pRRL-SFFV-TIR1-F74G：Narain等人（N/A）
apJET-HA-AID-Nterm-TRRAP-HR：N/A
apIND20-NLS-BirA?：N/A
apIND20-BirA?-B-MYB：N/A
apCDNA4/TO-HA-B-MYB：Pattschull等人（N/A）
apCDNA4/TO-HA-B-MYB 2–410：Pattschull等人（N/A）
apCDNA4/TO HA-B-MYB 411–700：Pattschull等人（N/A）
apCDNA4/TO HA-B-MYB 411–563：Pattschull等人（N/A）
apCDNA4/TO HA-B-MYB Δ418-563：N/A
apIND20-B-MYB.siRNA_resistent：N/A
apIND20-B-MYB ΔMuvB.siRNA_resistent：N/A
apIND20-B-MYB Δ418-563.siRNA_resistent：N/A
apIND20-B-MYB：N/A
apIND20-B-MYB ΔMuvB.siRNA_resistant：N/A
acbS-Flag-TRRAP：Addgene（Cat# #32103；RRID:Addgene_32103）
pCDNA 3xFlag-Pontin：Addgene（Cat# 51635；RRID:Addgene_51635）
pCMV-2xFLAG -TAF5L：N/A

**软件和算法**
HISAT（2.2.1）：Kim等人
featureCounts（2.0.8）：Liao等人
Alimma-voom（3.58.1）：Liao等人
ADAVID（v6.8）：Sherman等人
fGSEA（1.8.0）：Korotkevich等人
ABowtie（2.5.3）：Langmead等人
http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
DeepTools, Deeptools2：Ramirez等人
Integrative genomics viewer（2.19.7）：Robinson等人
ADepMap public release 25：Arafeh等人
Prism 11：GraphPad
R studio 2024.12.1 + 563：Posit Software
R 4.4.3：The R Foundation

**实验模型和参与者详情**
MCF10A-YAP5SA细胞在添加了5%马血清、1%青霉素/链霉素、20 ng/mL EGF、50 ng/mL霍乱毒素、10 μg/mL胰岛素和0.5 μg/mL氢化可的松的DMEM/F-12培养基中培养。A549细胞在添加了10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养。HEK293T和HepG2细胞在添加了10% FCS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。A549细胞通过短串联重复（STR）分析进行鉴定。所有细胞系定期通过PCR检测支原体污染，结果均为阴性。细胞按照指示接受了普雷克萨替布（CHK1i）、5-Ph-IAA、RO-3306（CDK1i）、NU9056（TIP60i）和TDI-011536（LATSi）的处理。在数据采集和处理方面，使用了Xcalibur 4.0（Thermo）和Tune版本2.9软件。BioID数据的分析采用了Spectronaut（v.16，Biognosys）中的directDIA流程，并设置了BGS参数，但调整了以下参数：插补策略=全局插补，蛋白质LFQ方法=QUANT 2.0，蛋白质类型过滤器=仅特定蛋白质组，主要组数量=肽的中位数数量，次要组数量=前体的中位数数量，数据过滤=Q值百分位数（0.2），标准化策略=基于中位数的全局标准化，行选择=在所有运行中都检测到的蛋白质。数据搜索使用了瑞士蛋白数据库（Swissprot）中的特定物种数据（Homo sapiens，20,186条记录）和污染物数据（247条记录），并考虑了氧化（M）、蛋白质N端乙酰化（Protein N-term）和生物素（Biotin，K）等变量修饰。允许每个样品最多有2次胰蛋白酶切割缺失和5个变量修饰。鉴定结果在肽和蛋白质水平上通过了1%的FDR（假发现率）筛选。相对定量分析在Spectronaut中进行，使用了每种条件下的重复样品。随后数据被导出并过滤出核蛋白，通过设定log2比值为1和q值<0.01来选择显著蛋白。使用Corum数据库通过Metascape软件进行了蛋白质复合体的富集分析。

在进行免疫印迹（Immunoblotting）和免疫沉淀（immunoprecipitation）实验时，细胞首先用TNN（50 mM Tris pH 7.5、120 mM NaCl、5 mM EDTA、0.5% NP40、10 mM Na4P2O7、2 mM Na3VO4、100 mM NaF、1 mM PMSF、1 mM DTT、10 mM β-甘油磷酸盐以及蛋白酶抑制剂混合液（Sigma）裂解。蛋白质通过SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，并使用一抗和二抗进行免疫印迹检测。对于瞬时过表达蛋白的免疫沉淀，HEK293T细胞用磷酸钙转染了10 μg的表达质粒。转染48小时后裂解细胞，加入抗-HA磁珠（Thermo Fisher Scientific），在0.05% Tween TBS中洗涤一次后，向磁珠中加入2.5–4 mg的蛋白质裂解液。样品在4°C下旋转孵育过夜，然后用TNN洗涤5次，再通过SDS-PAGE分离并使用相应抗体检测蛋白质。对于内源性蛋白的免疫沉淀，首先通过蔗糖缓冲液（10 mM HEPES pH 7.9、0.34 M sucrose、3 mM CaCl2、0.1 mM EDTA和0.5% NP-40）进行细胞离心分离以获得染色质结合组分。离心后，细胞用核质提取缓冲液（20 mM HEPES pH 7.9、3 mM EDTA、10% glycerol、150 mM potassium acetate和1.5 mM MgCl2）重新悬浮。使用Dounce匀浆器破碎细胞，在冰上孵育40分钟后再进行匀浆。样品与25 U的benzonase孵育1小时后离心，沉淀物重新悬浮在染色质提取缓冲液中（50 mM HEPES pH 7.9、1.5 mM MgCl2、150 mM potassium acetate），并在室温下旋转孵育30分钟，最后通过离心分离沉淀物，上清液与一抗孵育。经过4°C过夜孵育后，加入Protein A/G磁珠（Thermo Fisher Scientific）洗涤3次，然后用SDS-PAGE分离蛋白质并进行免疫印迹检测。

siRNA转染使用的siRNA来自Thermo Fisher Scientific，通过RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）以最终浓度5 nM转染到细胞中。siRNA序列列于表S5中。

总RNA使用Trizol（Thermo Fisher Scientific）提取，cDNA使用随机引物和RevertAid逆转录酶（Thermo Fisher Scientific）合成。实时定量PCR使用ABsolute QPCR SYBR Green Mix（Thermo Fisher Scientific）进行，而常规real-time PCR则使用qTower3G（Analytik Jena）设备。表达差异的计算方法如前所述，引物序列同样列于表S5中。

总RNA从三个生物学重复样本中提取，利用NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs）和magnetic mRNA isolation module从1 μg RNA开始构建DNA文库。DNA文库通过PCR扩增后，使用Fragment Analyzer（Advanced Analytical）分析质量，并在NextSeq 2000平台（Illumina）上进行测序（配对 ends，2 × 60 bp长度）。CUT&RUNCUT&RUN的具体步骤如下：首先分离细胞，将其与ConA包被的磁珠（Polysciences Europe）结合并使其通透化；随后加入非特异性IgG（2 μg，Sigma，I5006）或一抗（2 μg ChIP级抗-HA，Abcam ab9110或2 μg抗B-MYB pT487，Abcam ab76009），在4°C下孵育过夜；接着用含Digitonin的缓冲液洗涤细胞，并加入pA-MNase在4°C下孵育1小时；之后用低盐冲洗缓冲液洗涤细胞。加入含CaCl2和Digitonin的孵育缓冲液，在4°C下孵育30分钟，然后在20 μg/mL RNAse A的存在下停止MNase活性。在37°C下释放DNA片段，并在50°C下加入0.01% SDS和10 mg/mL Proteinase K进行解链1小时。DNA用苯酚-氯仿提取后重新悬浮在TE缓冲液中。使用NEBNext Ultra II DNA Library PrepKit（NEB #E7645S）构建文库，根据之前描述的方法调整流程以适应较短的DNA片段。文库经12个循环扩增后，在NextSeq 2000平台（Illumina）上进行测序（配对 ends，2 × 60 bp）。CUT&RUNCUT&RUN测序数据的浓度和大小分布通过NGS Fragment High Sensitivity Analysis Kit（1–6,000 bp；Agilent Technologies）进行分析，碱基 calling使用Illumina的BaseSpace平台完成。

细胞接种在96孔板（Revvity）中，固定前用10 μM EdU（Sigma）标记30分钟，然后用3% paraformaldehyde和2% sucrose在PBS中固定10分钟。接着用0.2% Triton X-100（Sigma）在PBS中通透化5分钟，再用3% BSA在PBS中封闭30分钟。EdU标记的DNA通过铜(I)-催化的叠氮-炔环加成反应在43 mM Tris pH 7.4、129 mM NaCl、4 mM CuSO4、20 μM AFDye 488 Azide（Jena Bioscience）和10 mM L-ascorbic acid条件下室温孵育30分钟进行检测。随后在4°C下用一抗孵育过夜，洗涤后用适当的荧光素偶联二抗在室温下孵育1小时。细胞核的染色使用2.5 mg/mL Hoechst 33342（PerkinElmer）在室温下孵育10分钟进行计数。图像使用Operetta CLS High-Content Imaging System（Revvity）以20倍或40倍放大倍数拍摄，图像处理和分析使用Harmony High Content Imaging and Analysis Software（Revvity）及R语言的自定义脚本完成。在EdU-Pulse-chase实验中，细胞在固定前用EdU处理指定时间点，之后用PBS洗涤三次并加入含50 ng/mL nocodazole的新鲜培养基。固定和染色步骤如前所述。

靶向siRNA筛选使用了Silencer Select Human Epigenetics siRNA Library（Thermo Fisher Scientific，A30085），该文库包含521个编码表观遗传和染色质相关因子的基因。每个基因选取三个独立的siRNA，使用Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）以最终总siRNA浓度7.5 nM共同转染到A549细胞中（96孔板）。筛选共进行了两次，每次作为独立的生物学重复实验。转染46小时后，细胞用100 nM prexasertib处理2小时以诱导早期有丝分裂和DNA损伤，然后用10 μM EdU标记30分钟。固定和染色后，使用Harmony软件和自定义R脚本计算EdU阳性S期细胞中γH2AX和pH3阳性细胞的数量。通过cellHTS2包计算稳健的Z分数，以确定哪些基因的缺失能抑制或增强CHK1抑制剂诱导的早期有丝分裂和DNA损伤。

MTT实验中，细胞接种在96孔板中，第二天分别用DMSO或1 μM 5-Ph-IAA和指定浓度的prexasertib处理。处理72小时后，向培养基中直接加入20 μL thiazolyl blue tetrazolium bromide（5 mg/mL）。在37°C下孵育2小时后，加入100 μL DMSO，在室温下孵育20分钟，使用微孔板读数仪在590 nm波长测量吸光度。吸光度值与无细胞的培养基阴性对照进行归一化，从而计算细胞存活率。

在RNA测序中，使用HISAT2（v2.2.1）将读段比对到Homo sapiens参考基因组hg38上，用featureCounts（v2.0.8）获取读段计数，并用limma-voom（3.58.1）识别差异表达基因。基因本体（GO）富集分析使用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery（DAVID）（https://davidbioinformatics.nih.gov）完成。快速基因集富集分析（fGSEA，v1.8.0）利用Molecular Signature Database（MSigDB）中的C2和hallmark基因集识别显著富集的信号通路。

CUT&RUN测序读段使用Bowtie 2比对到人类参考基因组（hg38），并筛选出唯一映射的读段/片段，最低映射质量要求为30。使用bamCoverage（deepTools）生成全基因组覆盖图谱，bing size设置为5 bp，使用RPGC（reads per genomic content）进行归一化，有效基因组大小设为2,701,495,761。RPGC归一化的bigWig文件用于可视化和定量信号分析。未应用外源性峰添加校正；因此，不同处理条件间的比较反映了相同基因组区域内的相对信号差异，而非绝对的基因组覆盖度校准结果。de novo TRRAP峰的识别使用MACS2软件完成，以DMSO和CHK1i条件作为处理输入，IgG数据集作为对照。峰调用使用paired-end BAM（binary alignment map）输入（BAMPE），有效基因组大小设为2.7 × 10^9，保留所有重复片段（--keep-dup all），最小片段长度为20 bp，mfold范围为5–50，带宽为300 bp。主要峰集包含q < 0.05的8,759个峰。此外还生成了q < 0.01和q < 0.001的峰集以评估峰调用结果的稳健性。

de novo B-MYB pT487峰的识别同样使用MACS2软件完成，以DMSO和IAA条件下的B-MYB pT487 CUT&RUN数据集作为处理输入，IgG数据集作为对照，参数设置与之前相同。主要B-MYB峰集包含q < 0.01的9,958个峰。额外的峰集用于评估检测的敏感性。使用ChIPseeker软件标记启动子相关峰，定义为距离注释的转录起始位点（TSS）±1 kb范围内的峰。MMB目标相关峰通过与该预定义的MMB target-gene集的重叠来识别。

CUT&RUN信号的RPGC归一化使用deepTools进行分析。对于de novo峰分析，计算Matrix时以MACS2定义的峰顶为中心进行参考点校正，并使用plotHeatmap和plotProfile生成热图和汇总曲线。定量分析中，计算每个TRRAP峰顶或MMB target-gene TSS ±500 bp范围内的平均RPGC归一化覆盖度。相同基因组区域在不同处理条件间的变化进行比较，生物学重复样本内的变化也进行了分析。通过比较DMSO组和IgG组的差异来评估富集程度。区域内的变化中位数和显示指定变化方向的区域比例也进行了统计分析。

统计比较分别针对每个生物学重复样本使用配对Wilcoxon signed-rank检验完成，预设的方向性比较包括DMSO > IgG、IAA < DMSO和IAA+CHK1i < CHK1i；CHK1i与DMSO的比较为双侧检验（n = 2个生物学重复样本；基因组区域在每个重复样本中视为配对观测，而非独立样本）。启动子占据定义为至少有一个峰位于注释的TSS ±1 kb范围内。基于RNA-seq数据，仅在A549细胞中表达的基因被纳入富集分析，共分析279个预定义的MMB目标基因，其中265个基因在A549细胞中表达并纳入分析。使用双侧Fisher精确检验评估了相对于表达背景基因集合，TRRAP或B-MYB启动子 occupied 在MMB靶基因中的富集情况。比值比（odds ratios）大于1表示MMB靶基因中存在富集现象。通过对MACS2 q值阈值分别为<0.05、<0.01和<0.001生成的峰值集进行评估，来考察对峰值检测严格性的鲁棒性。作为独立分析，还分析了所有279个高置信度MMB靶基因的TSS处TRRAP CUT&RUN覆盖情况的RPGC标准化结果。确定了每种条件下每个TSS周围±500 bp范围内的平均覆盖度，并进行了生物学重复实验。处理相关变化和统计比较按照上述方法计算。每个CUT&RUN文库的测序深度、比对率和过滤后的唯一映射片段数量也被确定。FRiP值是通过featureCounts（Subread）分配到相应峰值集的片段数量除以总片段数量计算得出的（见图S6）。使用Integrative Genomics Viewer（IGV）生成基因组浏览器轨迹。RNAi（DEMETER2）和CRISPR（CERES）基因依赖性得分来源于DepMap公共版本25Q3（Broad Institute，depmap.org）。通过成对完整观测数据，计算了MYBL2依赖性与所有其他基因在癌细胞系中的皮尔逊相关系数，并根据相关强度对基因进行排序。以TRRAP依赖性作为参考进行了相互分析。

**定量与统计分析**
统计分析使用GraphPad Prism 11（GraphPad Software）和R软件进行。数据以平均值±标准差的形式呈现。统计检验、独立重复实验次数和显著性水平在相应的图例中标明。n表示独立的生物学重复实验。RNA-seq和CUT&RUN测序数据的统计分析详见生物信息学部分。对于大于0.0001的值，报告精确的p值；对于小于0.0001的值，报告为p<0.0001。

**补充信息（10）**
- 下载全部数据：PDF格式（3.04 MB）
- 文档S1：图S1–S10
- 电子表格（18.35 KB）：表S1. 通过BioID鉴定的B-MYB相互作用伙伴，与图1相关
- 电子表格（18.87 KB）：表S2. 核B-MYB BioID相互作用组的基因本体（GO）富集分析，与图1相关
- 电子表格（23.03 KB）：核B-MYB BioID相互作用组与CORUM数据库中注释的基线转录复合物的比较，与图1相关
- 电子表格（29.90 KB）：siRNA筛选的稳健Z值，与图2相关
- 电子表格（10.92 KB）：表S5. 研究中使用的寡核苷酸和siRNA列表，与STAR方法相关
- 电子表格（1.99 MB）：表S6. TRRAP峰值区域的RPGC标准化TRRAP CUT&RUN覆盖情况
- 电子表格（432.95 KB）：表S7. MMB靶基因TSS处的RPGC标准化TRRAP CUT&RUN覆盖情况
- 电子表格（45.24 KB）：表S8. 通过MACS2鉴定的B-MYB pT487 CUT&RUN峰值
- PDF格式（14.67 MB）：文档S2. 文章及补充信息