两个相邻加氧酶基因SsOxy1和SsOxy2的功能鉴定揭示它们在核盘菌菌核发育、胁迫耐受和致病性中的关键作用

《Journal of Fungi》：Functional Characterization of Two Adjacent Oxygenase Genes, SsOxy1 and SsOxy2, Reveals Their Critical Roles in Sclerotial Development, Stress Tolerance, and Pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum

　　

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种臭名昭著的破坏性广寄主范围坏死营养型真菌，可造成全球范围内毁灭性的作物减产。尽管编码加氧酶的基因在真菌基因组中普遍存在，且所编码的酶在驱动多种生化级联反应中发挥重要作用，但它们在核盘菌致病过程中的具体功能谱仍然知之甚少。在此，研究人员鉴定了一对相邻的早期侵染诱导的加氧酶基因：SsOxy1（编码一种2-氧代戊二酸依赖性加氧酶）和SsOxy2（编码一种非血红素铁依赖性加氧酶）。靶向基因破坏实验显示了不同的发育功能：ΔSsOxy1突变体表现出营养生长受损（24小时时菌落直径减少约18%至27%）和菌核生物量显著减少（减少约8%至28%），而SsOxy2的缺失则选择性地解除了菌核生物发生的空间调控，但未限制径向生长。重要的是，两种突变体在多种寄主上均表现出毒力严重下降，ΔSsOxy1病斑直径减少约30%至67%，ΔSsOxy2减少约62%至66%（p < 0.01）。这种衰减根本联系于它们无法形成成熟的侵染垫，加之对外源氧化（H₂O₂）和高渗（NaCl）胁迫的超敏反应。非靶向代谢组学揭示了两种突变体共有的深刻代谢重编程，表现为嘌呤代谢中间产物严重耗竭，包括次黄嘌呤（4.6–4.9倍）、黄嘌呤（6.1–8.1倍）和鸟嘌呤（2.5–3.7倍），同时谷胱甘肽氧化还原池受到干扰（GSSG升高：ΔSsOxy1中3.0倍，ΔSsOxy2中5.7倍）。基因组共定位结合这些代谢组学变化表明，SsOxy1和SsOxy2可能在一个推定的次级代谢物生物合成基因簇内以协调方式起作用，但目前缺乏共转录和共享产物的直接证据。研究人员的发现为这对加氧酶如何调控氧化还原稳态、能量分配以及核盘菌成功寄主定殖所需的关键形态转变提供了新的机制性见解。

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种毁灭性的广寄主范围坏死营养型植物病原真菌，每年造成全球范围内的重大作物损失。当前防治策略高度依赖化学杀菌剂，但多菌灵、嘧菌酯和琥珀酸脱氢酶抑制剂等的长期使用已导致田间种群出现多药耐药性。该病原菌通过形成高度黑色素化的菌核在土壤中长期存活，成为病害再循环的主要初侵染源。成功侵染依赖于营养菌丝快速分化为复合附着胞，即侵染垫，并借助分泌细胞壁降解酶、草酸及效应蛋白等完成寄主定殖。近年来，真菌次级代谢产物在寄主-病原互作中的作用受到重视，而加氧酶作为次级代谢产物骨架的关键修饰酶，在核盘菌中的具体功能仍不清楚。为此，研究人员重点关注了基因组中相邻的两个侵染早期显著上调的加氧酶基因SsOxy1和SsOxy2，旨在揭示它们在菌核发育、胁迫适应和致病过程中的作用。

研究人员通过靶向基因敲除获得ΔSsOxy1和ΔSsOxy2突变体，并利用表型分析、致病性测定、胁迫敏感性试验和非靶向代谢组学等方法进行了系统研究。结果表明，SsOxy1缺失导致营养生长受抑、菌核生物量下降，SsOxy2缺失则特异性破坏菌核的空间分布；同时，两个突变体均无法形成成熟侵染垫，毒力大幅降低，并对氧化和高渗胁迫表现出超敏反应。代谢组学显示二者共同发生嘌呤代谢物耗竭和谷胱甘肽氧化还原失衡。该研究首次系统阐明了成对加氧酶在核盘菌中的多重功能，为开发新型杀菌靶点提供了理论依据，相关成果发表于《Journal of Fungi》。

本研究采用的主要技术包括：基于NCBI保守结构域数据库进行蛋白结构域注释和BlastP同源搜索，构建系统发育树；应用qRT-PCR检测侵染过程中基因表达动态；利用split-marker同源重组策略进行靶向基因敲除，并采用PCR和RT-PCR验证；通过菌落直径测量、菌核计数与鲜重测定评估生长和发育表型；使用离体油菜叶片（甘蓝型油菜‘中双11’）和活体本氏烟（Nicotiana benthamiana）进行致病性测定；以洋葱表皮为基质观察侵染垫形成；通过含H₂O₂、NaCl、山梨醇和铁化合物的培养基评价胁迫敏感性；采用非靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行代谢组学分析，结合KEGG富集解析差异代谢物。野生型菌株为西南大学植物保护学院保存的核盘菌1980菌株。

### 3.1 结构属性与侵染诱导转录

生物信息学分析表明，SsOxy1（SS1G_07964）含有2-氧代戊二酸依赖性加氧酶结构域（Pfam 03171），SsOxy2（SS1G_07963）含有非血红素铁依赖性加氧酶结构域（Pfam 14518）。系统发育搜索未在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）等近缘真菌中发现直系同源物，提示这两个基因可能是核盘菌谱系特异性获得的。qRT-PCR结果显示，SsOxy2在接种后4小时（hpi）表达水平急剧上升至峰值（约3.7倍），SsOxy1在12 hpi达到最大诱导（约37倍），呈现先后有序的诱导模式。

### 3.2 营养生长与菌核生物发生的分歧作用

通过靶向基因破坏获得ΔSsOxy1和ΔSsOxy2，每个敲除采用两个独立转化子进行表型验证。ΔSsOxy1在培养24小时时菌落直径较野生型减少18%–27%，并表现出高度分支的致密菌丝形态；菌核鲜重下降约8%–28%，且菌核空间分布不规则。ΔSsOxy2的径向生长速度与野生型无差异，但其菌核分布同样失去规则的同心圆模式，菌核数量和鲜重无显著变化，表明SsOxy2