人类胎儿葡萄膜道单细胞转录组图谱揭示黑色素细胞群体的异质性

《iScience》：Single-cell transcriptomic atlas of the human fetal uveal tract reveals heterogeneity in melanocyte populations

　　

葡萄膜黑色素细胞是来源于神经嵴的细胞，参与眼部色素沉着，但其发育异质性和微环境作用仍知之甚少。研究人员提出了人类胎儿葡萄膜道的单细胞转录组图谱，对来自8只眼睛、受孕后第12周和20周（PCW）的81,603个细胞进行了分型，涵盖14种细胞类型。在5,142个黑色素细胞中，研究人员鉴定出四个亚群，其中包括一个转录上独特的细胞群，在发育后期富集于后部葡萄膜组织。该群体表达NR2F1、FOXC1和PITX2，同时表达细胞外基质和血管生成相关基因，并预测其与施万细胞、内皮细胞和免疫群体通讯以调节葡萄膜微环境。多重免疫荧光证实胎儿脉络膜组织中存在MITF+/FOXC1+共表达细胞，从而在原位验证了该群体。来自该细胞群的精炼基因特征在三个独立的葡萄膜黑色素瘤队列中与高转移风险相关，并在单细胞数据中富集于侵袭性肿瘤细胞状态，提示发育程序重激活参与疾病进展。

葡萄膜黑色素细胞是胚胎期神经嵴来源的色素生成细胞，迁移并定植于虹膜、睫状体和脉络膜构成的葡萄膜道。尽管其色素合成功能明确，它们在脉络膜血管发育、光保护、免疫调节和组织稳态中的作用仍不完全清楚；脉络膜为视网膜外层提供约90%的氧供，黑色素细胞可能对脉络膜血管系统的形成和维持至关重要，但分子机制不明。葡萄膜黑色素瘤（UM）是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤，约90%发生于脉络膜，高风险转移性UM具有类似发育程序的转录组特征。已有的TCGA-UVM、Pandiani等、Durante等和Li等的测序研究刻画了UM的肿瘤内异质性，但正常胎儿葡萄膜黑色素细胞在发育窗口期的单细胞转录组图谱仍然缺失。为此，研究人员构建了人类胎儿葡萄膜道的单细胞图谱，相关成果发表在《iScience》。

研究人员从人类发育生物学资源库（HDBR）获取8只核型正常胎儿眼（12受孕后周4只、20受孕后周4只），沿锯齿缘将葡萄膜分为前、后两部分，使用10x Genomics Chromium平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），经质量过滤后获得81,603个细胞，其中5,142个黑色素细胞。使用Seurat、Harmony和Leiden算法进行聚类与注释；对黑色素细胞亚群进行差异表达、基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析（GSEA）分析；用CellChat推断细胞间通讯；用Opal多重免疫荧光在胎儿脉络膜组织原位验证；并将亚群基因特征在TCGA-UVM、GSE22138、GSE84976及Durante等UM单细胞数据集（GSE139829）中验证。

全胎儿葡萄膜单细胞数据聚类揭示14种主要细胞类型。研究人员对16个前/后葡萄膜数据集进行整合，经Harmony批次校正和Leiden聚类后得到17个初始聚类，经典型标志基因审查注释为14种细胞类型；均匀流形近似与投影（UMAP）可视化和标志基因点图确认了各细胞类型的身份。

单细胞分析揭示胎儿葡萄膜内四个黑色素细胞亚群。5,142个黑色素细胞在分辨率0.1下形成4个稳定聚类：聚类1为经典黑色素细胞，占85%；聚类3和聚类4分别为S期和G2M期为主的循环黑色素细胞，共占约6.25%；聚类2为转录独特的黑色素细胞，占8.75%。不同解剖位置、发育时间和供体样本在各聚类中均有代表，说明这些元数据不是聚类的主要驱动因素。

鉴定出一个转录独特的黑色素细胞亚群。聚类2包含450个细胞，仍高表达PMEL、MLANA和TYRP1，99.8%的细胞为三阳性，但核心黑色素细胞标志物的表达比例和平均水平略低。差异表达分析（log₂FC>2，min.pct=0.1）鉴定出634个上调基因，GO分析显示这些基因富集于细胞外基质（ECM）重塑、组织形态发生、神经系统发育、间充质与神经嵴发育、上皮-间质转化（EMT）和干性相关过程；KEGG分析富集到细胞骨架、黏着斑、轴突导向、PI3K-Akt和Wnt信号通路；GSEA也强富集EMT。按Δ表达排序得到114个近聚类2特异基因，包括ECM基因DCN、COL4A1、COL4A2、PCOLCE，发育转录因子FOXC1、PITX1、PITX2、FOXF2、NR2F1，以及信号分子THY1、PDGFRA、EDN3和ANGPT1。

聚类2黑色素细胞富集于后部、晚期葡萄膜组织。富集比分析显示，聚类2在后部葡萄膜（富集比1.04）和20 PCW组织（1.15）中富集，在前部葡萄膜（0.68）和12 PCW组织（0.64）中欠代表；Fisher精确检验均有统计学意义（解剖位置p=0.008，发育时间p<0.0001）。

细胞间通讯分析显示聚类2具有独特信号谱