《Animals》：Antisense Oligonucleotide-Mediated XIST Knockdown Modulates Endogenous Pluripotency-Associated Transcription Factor Expression in Porcine Female Somatic Cells
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长链非编码RNA XIST是X染色体失活的关键调控因子，并在细胞重编程过程中参与表观遗传调控。然而，XIST抑制是否影响猪体细胞中内源性多能性相关转录程序仍不清楚。在本研究中，研究人员探讨了XIST敲低对IBRS-2细胞中内源性多能性相关转录因子（plurip
长链非编码RNA XIST是X染色体失活的关键调控因子，并在细胞重编程过程中参与表观遗传调控。然而，XIST抑制是否影响猪体细胞中内源性多能性相关转录程序仍不清楚。在本研究中，研究人员探讨了XIST敲低对IBRS-2细胞中内源性多能性相关转录因子（pluripotency-associated transcription factors, pTFs）的影响。设计了靶向XIST的化学修饰反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）并转染至IBRS-2细胞。ASO处理后，XIST表达在长达120小时内被有效抑制。RT-qPCR分析显示，XIST敲低诱导了KLF4和LIF表达的持续上调、NANOG的延长间歇性激活以及G6PD的瞬时激活。相比之下，OCT4、SOX2和c-MYC仅在转染后早期阶段显著上调。在部分ASO-2处理的细胞中可检测到KLF4免疫荧光。这些发现表明，ASO介导的XIST敲低部分促进了猪雌性体细胞中一组内源性多能性相关基因的激活。本研究为XIST作为猪体细胞重编程过程中的表观遗传调控因子提供了新的见解，并提示优化的XIST干扰可能代表一种在不依赖外源转录因子递送的情况下增强内源性多能性相关基因激活的潜在策略。
论文解读：反义寡核苷酸介导的XIST敲低对猪雌性体细胞内源性多能性相关转录因子表达的调控作用
一、研究背景与科学问题
体细胞重编程技术在动物生物技术、胚胎工程和遗传改良领域具有重要意义，但其效率长期受限于表观遗传屏障，尤其是多能性相关基因的激活受阻。X染色体失活（X-chromosome inactivation, XCI）是雌性哺乳动物中平衡X连锁基因剂量的关键表观遗传机制，而长链非编码RNA XIST在此过程中发挥核心作用，通过包裹失活X染色体（inactive X chromosome, Xi）并招募染色质修饰复合物建立转录沉默。已有研究表明，在诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）和体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）胚胎的重编程过程中，X染色体再激活（X-chromosome reactivation, XCR）与多能性的获得密切相关。外源性多能性相关转录因子（pluripotency-associated transcription factors, pTFs）如OCT4、SOX2和NANOG能够抑制XIST转录并促进X连锁基因再激活。然而，单独敲低XIST是否足以激活内源性多能性网络尚不明确，且既往基于RNA干扰的策略由于XIST主要定位于细胞核而效果有限。因此，本研究旨在利用更适合靶向核定位长链非编码RNA的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）技术，系统探究XIST敲低对猪雌性体细胞内源性多能性相关基因表达的影响。
二、主要关键技术方法
研究人员使用了猪雌性肾上皮细胞系IBRS-2（来源于武汉普诺赛生命科技有限公司）作为实验模型。关键技术包括：设计并合成靶向猪XIST第一外显子的化学修饰ASOs（包含硫代磷酸酯、2′-O-甲基和锁核酸修饰），通过脂质体转染法导入细胞；采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因转录水平变化；利用免疫荧光染色检测KLF4蛋白表达。
三、研究结果
3.1 筛选靶向XIST的ASO
通过比较抗XIST shRNA质粒和ASOs的敲低效果，发现shRNA处理虽能降低XIST表达并上调KLF4和SOX2，但对NANOG和OCT4无显著影响。进一步筛选四种ASOs后，确认ASO-2具有最强的XIST敲低效果。在转染后24小时，ASO-2处理组中SOX2、NANOG和KLF4的转录水平显著上调，而OCT4无明显变化。
3.2 XIST敲低对多能性相关基因转录水平的影响
时间进程分析（24至120小时）显示，XIST表达在整个观察期内被持续抑制。KLF4表达呈现持续显著上调；NANOG在48小时、72小时和120小时保持显著上调；而SOX2、OCT4和c-MYC仅在转染后24小时短暂升高，随后在96和120小时显著下降。此外，信号通路基因LIF表现出持续上调，LEF1从48小时开始逐渐下降并维持抑制状态；X连锁基因G6PD在48和72小时短暂激活，随后在96和120小时下调。
3.3 XIST敲低对KLF4表达的影响
免疫荧光染色结果显示，在ASO-2处理120小时后，部分细胞中可检测到KLF4蛋白表达，同时FAM标记的ASO-2在细胞内广泛分布并部分定位于细胞核。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，ASO相较于shRNA在靶向核定位的XIST方面更具优势，这归因于RNase H主要分布于细胞核以及ASO的化学修饰增强了其靶点亲和力和核酸酶稳定性。XIST敲低后，其RNA丰度减少可能削弱了对染色质修饰因子、DNA甲基转移酶和转录因子在Xi上的招募，从而改变X连锁基因的转录状态。值得注意的是，KLF4的持续激活提示XIST可能参与内源性多能性相关转录程序的调控，但单独XIST敲低不足以实现完全的谱系重编程。LIF的持续上调可能通过LIF-Stat3信号轴促进表观遗传重塑，而LEF1的持续抑制可能与后续OCT4、SOX2和c-MYC的下调存在时序关联，提示Wnt/LEF1信号通路可能参与这一动态调控过程。
研究结论：综上所述，通过ASO-2介导的XIST敲低激活了IBRS-2细胞中一组内源性多能性相关转录因子。观察到XIST抑制后内源性KLF4和LIF的持续上调，以及NANOG、OCT4、SOX2、c-MYC和X连锁基因G6PD的分阶段激活。这些发现表明，XIST敲低能够在猪雌性体细胞中以基因特异性和时间依赖性方式部分调节内源性多能性相关基因。然而，单独的XIST敲低不足以诱导协调且持续的内源性多能性网络激活，并且这些转录变化是否有助于功能性体细胞重编程仍有待确定。
